2019 Fiscal Year Research-status Report
Identification of molecules that suppressed osteoclastgenesis in extracellular vesicles derived from osteosarcoma cells
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19K18529
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
荒木 麗博 金沢大学, 附属病院, 医員 (10800625)
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2019-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | NFATc1 / NFκB / IκBα / リン酸化抑制 / 血管新生 / 肺転移 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
in vitroにてマウス及びヒト骨肉腫細胞由来エクソソームを添加したマウス破骨前駆細胞（マクロファージ）において破骨細胞の分化が抑制されていることをTRAP染色にて確認した。その機序として破骨細胞分化の転写因子であるNFATc1をはじめ、その下流のDC-STAMP、OC-STAMP、Atp6v02dなどの分化誘導分子が有意に抑制されていることをmRNAレベルでqRT-PCRにて確認し、さらにRANKL刺激後のNF-κB経路でNF-κB及びIκBαのリン酸化がタンパクレベルで抑制されていることをWestern blottingで確認した。これらのことから骨肉腫細胞は骨微小環境において、その分泌するエクソソームによってNFκB経路のリン酸化を抑制し、破骨細胞の分化を抑制しているという機序が解明された。さらにエクソソームの分泌・排出を制御する分子のひとつであるTSG101をknock outしたマウス骨肉腫細胞を樹立し、Wild typeのマウス骨肉腫細胞との違いを腫瘍担持マウスにおいて組織学的評価及びその生存率について評価を行った。腫瘍組織自体のKi-67indexは有意に減少し、腫瘍周囲組織においてCathepsinK陽性の破骨細胞の有意な減少、CD31、CD34及びVEGFAの発現の有意な減少を認めた。マウス肺組織においても転移巣の数及び転移の面積も有意に減少を認めた。マウスの生存率(n=8)もKaplan-Meir曲線にて有意差を認めた。これらのことから、骨肉腫細胞由来エクソソームが腫瘍の局所における血管新生を通して浸潤を促進し、遠隔で肺転移を促進していることが示された。以上のことから、悪性度の高い腫瘍はエクソソームを多量に排出し、その中の分子が破骨細胞の分化を抑制し、血管新生を通じて局所の浸潤や転移を促進していることがin vitro及in vivoともに示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初計画した研究は順調に遂行できており、結果も伴ってきていると判断している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は質量分析を通してエクソソーム内の分子の中で、破骨細胞の分化の抑制に寄与している分子を同定していく。比較するエクソソームとして、骨肉腫細胞とそのNegative controlの細胞を設定するため、破骨細胞の分化に影響を与えないエクソソームを排出する細胞の探索が必要である。
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| Causes of Carryover |
当初見込んでいた金額よりも少ない金額で材料費や薬剤の購入ができたため、次年度の使用額が生じました。次年度に行う実験において、質量分析など外部委託費に充てたいと考えております。
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