2019 Fiscal Year Research-status Report
自己免疫性精子形成障害における自己抗原の同定～種を越えた共通抗原の同定～
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19K18572
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| Research Institution | Tokyo Medical University |
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Principal Investigator |
永堀 健太 東京医科大学, 医学部, 助教 (50759561)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 精巣 / 自己抗原 / 精巣炎 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
精子細胞・精子は自身の免疫系により異物として認識されるが、血液-精巣関門によって免疫系から完全に守られていると考えられている。しかし、ヒト特発性精子形成障害の精巣生検では、免疫グロブリン・補体沈着が認められる症例も多く、自己免疫機序が関与している可能性が高い。しかしながら、これまでに自己免疫性精巣炎が惹起される自己抗原や共通抗原の詳細は未だ明らかになっていない。2019年度においては、応募者が同定した18種類の自己抗原候補分子をComplete Freund's adjuvant(CFA)とBordetella pertussis(BP) を混合して14日間隔で2回皮下注射し、経時的（40日後、120日後）に精巣、脳、腎臓、腸管を摘出し、組織学的に解析した。また、コントロール群には、自己抗原候補分子を精製する際に用いた緩衝液とCFAとBPを混合したもの皮下注射し、同様に解析を行った。40日後においてはマウス体重・精巣重量に変化は認められなかった。しかしながら、120日後のマウス体重は実験群で変化は認められなかったが、精巣重量は自己抗原候補分子を皮下注射した実験群（熱ショックタンパク質（HSP）、GTPase活性化タンパク質（GIT）など）において有意に減少した（p<0.05）。精巣の組織学的観察では接種後40日目には精巣白膜周辺に多少のリンパ球が認められるようになり、120日目には精子形成障害を伴う自己免疫精巣炎様の炎症反応が高頻度に起きることが確認された。また、脳や腎臓、腸管をはじめとする他の臓器についても組織的観察を行ったが、炎症反応は認められなかった。したがって、今回精巣炎が観察された自己抗原候補分子（HSP、GITなど）は精巣に特異的に炎症を引き起こす分子であることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
精巣には、精祖細胞・精母細胞・精子細胞・精子の一連の生殖細胞群が存在するが、このうち精子細胞・精子は、免疫系の発達以降に分化成熟するため、精子を含む雄性生殖細胞には多くの非自己として認識される抗原分子が含まれている。しかしながら、これまでに自己免疫性精巣炎を引き起こす自己抗原分子についてはこれまでに報告はない。今年度の結果により、自己抗原候補分子の中でも熱ショックタンパク質（HSP）、GTPase活性化タンパク質（GIT）などをはじめとするいくつかの分子において精巣炎が引き起こされることが示唆された。本年度の研究結果は、マウス自己免疫性精巣炎を誘起する自己抗原を示唆する重要なデータであり、ヒトをはじめとした多種にわたる自己免疫性精子形成障害を誘起させる抗原の同定に繋がる有用なデータである。
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| Strategy for Future Research Activity |
2020年度は、雄性生殖細胞を用いて誘起した実験的自己免疫性精巣炎モデルマウスからリンパ球を採取し、自己抗原候補分子との反応性を確認する。今年度において自己抗原候補分子をCFAとBPとともに接種したところ、接種後40日目と120日目に白膜または精細管周囲にBリンパ球およびTリンパ球の浸潤が認められた。したがって、ex vivo評価法を用いてリンパ球と自己抗原分子を共培養後、培養上清を回収し、ELISA法で、各種サイトカインやリンパ球増殖能などを解析する。ex vivo評価法に用いるリンパ球は実験的自己免疫性精巣炎を引き起こしたマウスの脾細胞から採取し、フローサイトメトリーを用いてBリンパ球とTリンパ球をそれぞれ分離して解析を行う。また、自己抗原分子と共培養して増幅させたリンパ球（1×10e6~5×10e7 cell/200μl）をマウスに尾静脈養子移植を行い精巣にどのような変化を引き起こすかを観察する。さらに、自己抗原候補分子接種による精子の構造、運動性、妊孕能力の変化についても解析していく。自己抗原候補分子を接種した実験群の中には精細管内の精子形成が残っているものもあり、精巣上体中にもいくつか精子がたまっていることが確認された。これらの残っている精子についてどのような変化があるかを確かめるために組織学的解析、精子運動解析、同系メスマウスを用いた妊孕率解析を行い詳しく解析を行っていく。
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| Causes of Carryover |
ヒトをはじめとした多種にわたる自己免疫性精子形成障害を誘起させる自己抗原を同定するために、マウス実験的自己免疫性精巣炎モデルマウスから同定した自己抗原候補分子をマウスに接種した結果、予想より高頻度で精巣炎が発症したためサンプルが早く集まり、マウスの使用金額を抑えることができた。また、あらかじめ実験方法を確認し、抗原投与量をしっかり設定していたことによって実験試薬の浪費が少なく使用金額を予定より抑えられたことも理由に挙げられる。
次年度は、細胞培養をはじめとした新たな実験が始まり、今年度に比べ自己抗原候補分子の精製が多く必要であることから、未使用額はその経費に充てることとしたい。また、実験の進行具合によってはマウスだけでなくラットやモルモットなどの手近な実験動物を用いて自己抗原候補分子を接種させ精巣に炎症反応を引き起こすのかについても検討していきたい。
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