ヒトiPS細胞を用いた気管軟骨再生のための基盤技術開発

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K18803
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 樋渡 直 京都大学, 医学研究科, 客員研究員 (10808778)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: ヒトiPS細胞 / 神経堤細胞 / 間葉系幹細胞 / 甲状軟骨 / ゼノグラフト / X-SCIDラット / ヌードラット / 軟骨再生

Outline of Annual Research Achievements

本研究ではヒトiPS細胞から間葉系幹細胞(MSC)への分化誘導を行い、さらに軟骨細胞へと分化させ、免疫不全ラットを用いた気管軟骨欠損モデルへと移植し、移植細胞の生着と軟骨再生効果を検討する。
昨年度iPS細胞研究所、池谷研究室で開発されたゼノフリーでの神経堤細胞を介する分化誘導プロトコールを用い、ヒトiPS細胞からMSCへの分化誘導後spheroidを形成させた。当初の研究計画では軟骨分化させてからの移植としていたがゼノグラフトでの免疫拒絶を防ぐため、MSCのままでの移植に変更した。軟骨分化誘導の検討が省かれたため、令和2年度－3年度にかけて行う予定であった免疫不全動物への移植実験を前倒しして着手した。移植のレシピエントとして、免疫不全ラットの甲状軟骨に軟骨欠損を左右対称性に作成し、片側にのみiPS細胞由来MSC spheroidの移植を行った。移植後、一カ月ごと二か月後に組織採取を行った。予備実験例において移植部に免疫組織化学で抗ヒト核抗体陽性細胞(移植細胞の生存) を認め、アルシャンブルー染色で同部位に再生軟骨組織を認めた。本年度は前年度予備実験の結果をもとに実験数を増やして本実験を行った。NBRP-Rat 分担機関、東京大学医科学研究所 実験動物研究施設、真下知二先生より御供与頂いたX-SCIDラットを用いて移植実験を行い、生着と軟骨再生が確認されたためこの結果をまとめ論文投稿しStem Cell Researchに受理された。
さらにMSCは免疫系を惹起しないとの報告がある為、X-SCID ラットよりも免疫系の機能が保たれているヌードラットで同様の移植と解析を進めており、一部の回収組織において抗ヒト核抗体陽性の軟骨組織再生を認めている。安定した分化誘導および手術手技が確立されており、条件検討は不要であるため、研究計画も遅れることなく実現する事ができる。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

昨年度に令和2年度－3年度にかけて行う予定であった免疫不全動物への移植実験に関し予備検討を行っていたため、今年度はその結果を踏まえて、X-SCIDラット14匹を本実験として用い、ラット甲状軟骨欠損部位にヒトiPS細胞由来MSCを移植し、移植後4週間目および8週間目にラット喉頭を採取し、組織評価を行った。
移植した14匹全例で移植部位に一致してヒト核抗体 (human nuclear antigen: HNA)陽性細胞を認め、移植細胞の生着が確認された。右側には欠損部位に軟骨組織を認めなかったが、左側では術後4週で5/7例、術後8週で5/7例においてHE染色で正常軟骨に特徴的な小腔形成を示す軟骨様組織を移植部位に認めた。また、軟骨様組織再生部位に一致してHNAおよび軟骨分化マーカーであるSOX9抗体の共発現を認め、軟骨の細胞外基質の評価に用いられるAlcian Blue染色、Safranin O染色では、同部位に正常硝子軟骨と類似した染色陽性組織を認めた。さらに、I型・II型コラーゲン抗体を用いた免疫組織化学ではHNA陽性細胞の周囲にもII型コラーゲン抗体陽性、I型コラーゲン抗体陰性の硝子軟骨組織再生を認めた。上記結果を論文にまとめて2021年2月4日にStem Cell Researchに受理された。ヌードラットで同様の移植と解析を進めており、一部の回収組織において抗ヒト核抗体陽性の軟骨組織再生を認めている。

Strategy for Future Research Activity

I. ヌードラットを用いた甲状軟骨欠損部モデルへのヒトiPS細胞由来MSCの移植
令和2年度に論文として報告した移植実験では免疫不全動物としてX-SCIDラットを選択していた。本来MSCは移植治療において免疫制御能を発揮するといわれているため、重症複合免疫不全ラットよりも免疫反応が惹起されると予想されるヌードラットで同様の軟骨再生効果が得られるのかを検討するため、現在移植を遂行している段階にある。
II. 移植後細胞生着確認および軟骨組織再生効果の検討
Iで用いた移植例に対して、移植後4週間目および8週間目にラット喉頭を採取し、下記の評価を行い、結果をまとめる。① 移植細胞の生着：抗ヒト核抗体を用いた免疫組織化学で確認する。② 軟骨組織再生の有無：硝子軟骨組織再生効果をアルシャンブルー染色、サフラニンO染色で確認する。さらなる軟骨組織再生の検証のためII型コラーゲンとSox9に対する免疫組織化学を追加し、再生組織中の線維軟骨の有無をI型コラーゲンに対する免疫組織化学で確認する。③ 腫瘍形成の有無をHE染色で確認する。
上記事項を論文にまとめて、英文校正後、投稿し、必要なリバイス実験を経て受理を目指す。

Causes of Carryover

COVID-19感染症の影響で購入予定試薬の納品が大幅に遅れるとの連絡があったため、急遽発注を取り下げ、次年度の発注としたため次年度使用額が生じた。2021年4月以降に予定していた試薬を発注購入し、研究を進める予定である。

Research Products

• [Journal Article] In vivo regeneration of rat laryngeal cartilage with mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells via neural crest cells (2021)
  • Author(s): Masayoshi Yoshimatsu, Hiroe Ohnishi, Chengzhu Zhao, Yasuyuki Hayashi, Fumihiko Kuwata, Shinji Kaba, Hideaki Okuyama, Yoshitaka Kawai, Nao Hiwatashi, Yo Kishimoto, Tatsunori Sakamoto, Makoto Ikeya, Koichi Omori
  • Journal Title: Stem Cell Research Volume: 52 Pages: 102233
  • DOI: 10.1016/j.scr.2021.102233.
  • Peer Reviewed / Open Access