Analysis of dynamic interaction and folding process of a nascent polypeptide in living cells

2019 Fiscal Year Final Research Report

• Project/Area Number: 19K21179
• Project/Area Number (Other): 18H06047 (2018)
• Research Category: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• Allocation Type: Multi-year Fund (2019); Single-year Grants (2018)
• Review Section: 0701:Biology at molecular to cellular levels, and related fields
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: Miyazaki Ryoji 京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 特定研究員 (30827564)
• Project Period (FY): 2018-08-24 – 2020-03-31
• Keywords: 翻訳停止配列 / in vivo光架橋法 / 翻訳途上ポリペプチド鎖 / タンパク質相互作用 / フォールディング

Outline of Final Research Achievements

In this study, I attempted to develop a method for analyzing the behavior of proteins at each step of translation in a living cell.
To this end, I constructed a nascent polypeptide by fusing a translation arrest sequence to target proteins, and carried out the in vivo photo-cross-linking experiments to analyze folding/interaction of the nascent polypeptide. It was found to be difficult to perform the above approach because the stability of the constructed nascent polypeptides in a living cell was altered by the introduction site of the arrest sequence. Therefore, I analyzed the intracellular behavior of VemP that contains its orginal arrest sequence. I found that an in vivo photo-cross-linking approach can analyze the dynamic interaction of a VemP nascent polypeptide, and demonstrated that the molecular behavior of nascent polypeptide can be analyzed in a living cell.

Free Research Field

細胞内生化学

Academic Significance and Societal Importance of the Research Achievements

タンパク質の機能を明らかにするためには、成熟体が構築した後の振る舞いだけでなく、リボソームと結合した翻訳途上ポリペプチド鎖の動態を理解しなければならないという認識が徐々に強まってきている。しかしながら、細胞内での翻訳途上鎖の分子動態を解析できる手法はほとんどなかった。
そこで、本研究では、in vivo光架橋法を利用して翻訳途上鎖の相互作用やフォールディングを解析可能な手法の構築を試みた。その結果、翻訳伸長反応が安定に停止する「翻訳停止配列」を有するタンパク質をモデル基質として利用することで、細胞内で翻訳途上鎖の動的な相互作用を解析できることを示せ、タンパク質研究の基盤となり得る基礎を築いた。