2019 Fiscal Year Research-status Report
小型野生ネコの保全を目的とする非侵襲的なドナー細胞の採取とクローン胚作製への応用
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19K22311
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
宗 知紀 九州大学, 農学研究院, 助教 (90221340)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山内 伸彦 九州大学, 農学研究院, 准教授 (00363325)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2022-03-31
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| Keywords | ネコ / 体細胞クローン / ドナー細胞 / 糞 / 卵母細胞 / 体外成熟 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は小型野生ネコ保全の手段としての体細胞クローン作製技術を開発するため、その基礎的情報を収集することを目的としている。体細胞クローン作製にはドナーとなる体細胞とレシピエントとなる成熟卵母細胞が必要となる。しかし小型野生ネコから体細胞を採取するためには非侵襲的であることが絶対的な条件である。そこで本研究では、近縁種であるイエネコをモデルとし、動物病院などで避妊手術を行うときに得られる糞と雌猫の廃棄卵巣から、ドナー細胞とレシピエント細胞を得ることを検討した。
ドナー細胞採取：糞表面をPBS／PVAで洗い流し、得られた溶液を遠心分離すると、沈殿物に生きた細胞が存在していることを確認した。また、得られた糞の凍結切片を作成してヘマトキシリン・エオシン染色をすると糞表面に細胞が存在した。さらに糞より抽出したDNAからネコ特異的な配列が存在することがPCRによって確認された。
レシピエント卵母細胞採取：避妊手術で得られた卵巣を4℃または35℃で保存し、研究室まで輸送した。結果的に保存温度は4℃の条件の方が卵母細胞の成熟率がよかった。細切法により卵巣から卵丘卵子複合体を採取し、成熟培地（TCM199＋10IU／ml hCG, 0.1IU hMG, 1μl/ml E2）中で24時間培養（38℃, 5%CO2）した。成熟率は5カ月齢以上の個体より得られた卵母細胞が、それより若い個体から得られた卵母細胞より高く、細胞質の色が黒くかつサイズも大きかった。正常に成熟した培養後卵丘細胞を除去し、第二減数分裂中期（MⅡ期）まで到達した卵母細胞に単為発生処理を行った。単為発生処理（卵子活性化）はストロンチウム処理より電気刺激の方が効率的であった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2019年度から本研究を開始し、小型野生ネコのモデルとしてイエネコを用い、動物病院で避妊手術の際に得られる糞と廃棄される卵巣を利用して、ドナー細胞とレシピエント卵母細胞が得られる可能性が示された。糞表面に腸粘膜から剥がれ落ちたと思われる生きた体細胞が付着していることが明らかになった。また卵巣から卵丘卵子複合体がたくさん得られるが、幼若な個体と成体では卵母細胞の細胞質が異なっていることが明らかとなり、レシピエント卵母細胞の培養条件を探索する指標が示された。
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| Strategy for Future Research Activity |
ドナー細胞：糞からの細胞採取をより効率的にするため、糞全体を緩衝液に浸し、撹拌して濃度勾配遠心により夾雑物を分離する。これにより体細胞の単離方法の改善を検討する。
レシピエント卵母細胞：卵巣から最も多く得られる1次卵胞を成長培地で培養し、より多くの成熟卵母細胞を得られる条件を探索する。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた理由と使用計画：購入しようとした消耗品費に不足したため、翌年度分と合わせて、必要な消耗品費に充てる予定にした。
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