2022 Fiscal Year Annual Research Report

小型野生ネコの保全を目的とする非侵襲的なドナー細胞の採取とクローン胚作製への応用

Research Project

Project/Area Number	19K22311
Research Institution	Kyushu University
Principal Investigator	宗知紀九州大学, 農学研究院, 助教 (90221340)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	山内伸彦九州大学, 農学研究院, 准教授 (00363325)
Project Period (FY)	2019-06-28 – 2023-03-31
Keywords	フィルター法 / 除核法 / ウシ代用
Outline of Annual Research Achievements	本研究は小型野生ネコ保全の手段としての体細胞クローン作製技術を開発するため、その基礎的情報を収集することを目的としている。体細胞クローン作製にはドナーとなる体細胞とレシピエントとなる成熟卵母細胞が必要となる。しかし小型野生ネコから体細胞を採取するためには非侵襲的であることが絶対的な条件である。そこで本研究では近縁種であるイエネコをモデルとし、動物病院などで避妊手術を行うときに得られる糞と雌猫の廃棄卵巣から、ドナー細胞とレシピエント細胞を得ることを検討した。【ドナー細胞採取】糞表面をPBS/PVAで洗い流し、得られた懸濁液を遠心分離すると、沈殿物に生きた細胞が存在していることを確認したが、より多くのドナー細胞を採取するため、排せつ直後の糞をPBS/PVA中で緩やかに撹拌し、荒い濾紙でろ過したのち、遠心分離した。沈殿物を再懸濁したのち濃度勾配法あるいは2重フィルター法で細胞を分離した結果、2重フィルター法がはるかに効率が良いことが分かった。コロナ禍でウシの尿を代用できるか検討した結果、尿由来の体細胞が利用できることが示唆された。【レシピエント卵母細胞除核】細胞質の色が黒くかつサイズも大きい卵母細胞を選び、正常に成熟した卵丘卵母複合体より卵丘細胞を除去し、第二減数分裂中期（MⅡ期）まで到達した卵母細胞に単為発生処理を行った。単為発生処理（卵子活性化）は電気刺激法をもちいた。除核についてはデメコロシン処理によって第二減数分裂後の核が第二極体とともに細胞膜から突出するので、容易に行えることが確認された。コロナ禍によりネコの卵巣提供が激減しているため、購入可能なウシ卵巣を代用して、マニュピレータによる除核の手技を向上することができた。そこで、ウシ卵母細胞と同時に採取できる卵丘細胞をドナー細胞として、卵母細胞除核却後核移植を試みた。しかし卵割が認められたが、その後の発生は見られなかった。