Formation of collagen bandles with micron-order diameter in sturgeon collagen: the mechanism of formation and bioactivity

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K22322
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 都木 靖彰 北海道大学, 水産科学研究院, 教授 (10212002)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 柚木 俊二 地方独立行政法人東京都立産業技術研究センター, 開発本部開発第二部バイオ応用技術グループ, 上席研究員 (20399398) ; 成田 武文 地方独立行政法人東京都立産業技術研究センター, 開発本部開発第二部バイオ応用技術グループ, 研究員 (20640056) [Withdrawn] ; 畑山 博哉 地方独立行政法人東京都立産業技術研究センター, 開発本部開発第二部バイオ応用技術グループ, 副主任研究員 (80614552) ; 浦 和寛 北海道大学, 水産科学研究院, 准教授 (90360940)
• Project Period (FY): 2019-06-28 – 2022-03-31
• Keywords: 魚類コラーゲン / 大直径コラーゲン線維 / 組織工学 / 細胞足場マトリクス / 水産加工副生物

Outline of Annual Research Achievements

研究実施計画　1．Ⅰ型線維形成，Ⅰ＋Ⅱハイブリッド型線維形成過程の詳細観察　分担者が所属する東京都産業技術研究センターに導入された温度制御装置付の新型顕微鏡を用いることで，当初予定していた予定していたAFMよりも簡便かつ詳細に線維形成過程を観察することが可能になった．
研究実施計画　2．SBC線維の細胞機能活性化能の実証　SBC線維上で培養したMC3T3-E1骨芽細胞の分化初期（培養1日目）と後期（培養21日目）の遺伝子発現を，マイクロアレイを用いて網羅的に解析し，当初予測とは逆にコラーゲン線維に接着した細胞では多くの遺伝子の発現が抑制されることを示した．しかし，フィブロネクチンやVIII型コラーゲン遺伝子など，いくつかの細胞外基質遺伝子の発現は増加していた．このことから，コラーゲン線維に接着したMC3T3-E1骨芽細胞では，ある特定の遺伝子の発現が活性化される可能性が示唆される．一方で，コラーゲン線維に接着することが in vivo の状態に近いと考えると，コラーゲン分子に接着したMC3T3-E1骨芽細胞は，生体の骨折部位に観察されるような，外部刺激により骨芽細胞が活性化された状態にあるものと想像される．また，足場の物理的・化学的シグナルを感知することで細胞形態や増殖，分化を変化させる焦点接着（ビンキュリン）とそれに結合するF-アクチンを蛍光免疫染色し共焦点レーザー顕微鏡（CF-LSM）で観察したところ，コラーゲン線維に接着したMC3T3-E1骨芽細胞では分子に接着した細胞とはまったく異なる分布を示し，線維と分子ではまったく細胞接着機構が異なることが予想された．このことが分子と線維に接着した細胞の遺伝子発現を変化させる機構として細胞接着の様式の違いが予想される．

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

理由：　COVID-19による研究室閉鎖や外国人の渡日停止の影響を大きく受けている．研究実施計画　1．Ⅰ型線維形成，Ⅰ＋Ⅱハイブリッド型線維形成過程の詳細観察　は，東京都産業技術研究センターが分担しているが，研究室閉鎖等による研究ができない状況が続き，結論を下せるようなデータを出すに至らなかった．研究実施計画　2．SBC線維の細胞機能活性化能の実証　のマイクロアレイ研究では，コラーゲン線維とコラーゲン分子に接着したMC3T3-E1骨芽細胞の遺伝子発現を比べて発現が有意に変化する候補遺伝子の特定まではできたが，qPCRを用いた正確な発現変化の定量的解析には至らなかった．本課題は19年10月に交換留学性として華中農業大学（中国）から我々の研究室に留学し，いったん帰国して大学を卒業後20年10月修士課程に入学した中国人留学生が担当している．しかし，2020年10月以降も渡日できず，中国にてリモートの研究指導により研究を進めている．マイクロアレイのデータ解析は可能であったが，qPCRをおこなうことはできなかった．

Strategy for Future Research Activity

研究実施計画　1．Ⅰ型線維形成，Ⅰ＋Ⅱハイブリッド型線維形成過程の詳細観察　では，新型顕微鏡による観察を続け，線維形成機構，特にその初期段階に関して確実な見解を得る．COVID-19の感染は続いているものの，東京都産業技術研究センターにおける研究は推進可能になったので，2021年度中に予定した研究推進が可能であると考えている．

研究実施計画　2．SBC線維の細胞機能活性化能の実証　では，依然として外国人の渡日が不可能であるため，華中農業大学の協力を得て，コラーゲン分子，線維上でMC3T3-E1骨芽細胞を培養し，マイクロアレイで大きく発現が変化した遺伝子のqPCRをおこなう体制を構築中である．2021年度中にマイクロアレイ解析の結果をqPCRで検証する．

「現在までの進捗状況」の項に述べたように，COVID-19の影響で研究進捗が阻害されたため，mRNAや培養細胞など貴重な試料を保管するニーズが格段に増えた．そのため，超低温フリーザーを購入して試料の保管にあたっている．2021年度の研究ではこれらの試料を用いた研究も推進する．

Causes of Carryover

「現在までの進捗状況」の項で説明したように，COVID-19による研究室閉鎖や外国人の渡日停止の影響を大きく受けたことで研究の進捗が遅れた．研究実施計画　1．Ⅰ型線維形成，Ⅰ＋Ⅱハイブリッド型線維形成過程の詳細観察　では，観察は可能になったものの，確実な結論を下せるようなデータを出すに至らなかった．研究実施計画　2．SBC線維の細胞機能活性化能の実証　のマイクロアレイ研究では，マイクロアレイのデータ解析は終了したが，qPCRによる検証をおこなうことができなかった．繰り越した資金を用いて，これらの研究成果を2021年度に確実に出す（研究内容に大きな変更はない）．