2021 Fiscal Year Annual Research Report
development of a method to analyze local organelle function in situ
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19K22509
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| Research Institution | University of Fukui |
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Principal Investigator |
松岡 達 福井大学, 学術研究院医学系部門, 教授 (00263096)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
竹内 綾子 福井大学, 学術研究院医学系部門, 准教授 (00378704)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2022-03-31
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| Keywords | ミトコンドリア / 膜電位 / 微小電極 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
微小電極を心筋細胞に応用して、ミトコンドリア膜電位の測定を試みた。細胞は、ミトコンドリア密度が比較的低い、マウス心房筋由来培養細胞HL-1とマウス洞房結節細胞を用いた。心筋細胞に膜電位感受性色素であるTMRE (Thermo Fisher)またはTMRM(Thermo Fisher)を負荷してミトコンドリアを標識した場合、マニピュレータ操作で電極をミトコンドリア近傍に移動する間（約5分）に退色した。膜電位非依存性の選択的ミトコンドリア色素であるMitoTracker Green(Thermo Fisher)を用いてミトコンドリアを標識したところ、マニピュレータ操作中の著明な退色は見られなかった。長時間のミトコンドリア蛍光観察にはMitoTracker Greenが適していると考えられた。
汎用型のマイクロピペット作成装置または自重落下とマグネット双方の力を利用した縦引き型マイクロピペット作成装置を用いて、芯入りのガラス管から微小電極（先端直径＜１μm）を作成した。後者の方がより先端径が小さい電極が作成された。電極内液は1M KCl、細胞外液は無Ca2+ Tyrode液とした。100倍の対物レンズ付きの倒立顕微鏡下に実験を行った。HL-1細胞の場合、細胞膜が柔らかいためか、電極を細胞内に刺入することがやや困難であったが、洞房結節細胞では比較的成功した（刺入は膜電位変化で確認）。ミトコンドリア近傍まで、電極を移動したが、ミトコンドリア膜電位に相当する大きな膜電位降下は見られなかった。原因として、微小電極によるミトコンドリア損傷による膜電位の脱分極が考えられた。
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