2019 Fiscal Year Research-status Report
Gene therapy for CMT1A using AAV harboring artificial microRNAs
| Project/Area Number |
19K22606
|
|---|
| Research Institution | National Center of Neurology and Psychiatry |
|---|
Principal Investigator |
井上 健 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター, 神経研究所 疾病研究第二部, 室長 (30392418)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2021-03-31
|
| Keywords | ゲノム重複変異 / Charcot-Marie-Tooth病1A型 / PMP22 / 人工miRNA / アデノ随伴ウィルス(AAV) / 遺伝子発現抑制 / 遺伝子治療法 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
もっとも頻度が高い遺伝性ニューロパチーシャルコー・マリー・トゥース病1A型（CMT1A）の遺伝子治療を可能にするためにシュワン細胞特異的にPMP22遺伝子の発現抑制ができる人工miRNAを搭載したアデノ随伴ウィルス(AAV)を開発し、その有効性を実証する。本研究の目的を達成するためには、これまで困難であった複数の課題の解決が必要である。すなわちAAVによるシュワン細胞への特異的かつ高効率の遺伝子導入、細胞特異的発現が可能なRNAiユニットの開発、適切な遺伝子抑制レベルのコントロールなど、これまでの遺伝子治療の枠を超えた技術を組み合わせた方法を用いる必要がある。そこで本申請では、改変ヒトMPZプロモーターを開発し、PMP22特異的発現抑制を可能にする人工miRNAユニットと組み合わせたこれまでにないシュワン細胞特異的PMP22標的人工miRNA搭載AAVベクターを開発し、これらの課題を解決する。
本年度は、シュワン細胞特異的高効率発現プロモーターの設計を行った。PMP22は、シュワン細胞の成熟と髄鞘化開始に伴って発現が上昇する髄鞘膜蛋白質をコードするため、その発現パターンに合わせたプロモーターの使用が必要である。そこで我々は、成熟シュワン細胞での特異的発現が知られているラットMPZ遺伝子プロモーターの配列情報をもとに種間の塩基配列保存度の高いプロモーター領域をヒトMPZ遺伝子から抽出し、さらにイントロン１にある特異的エンハンサー配列をその５’端に結合することにより、改変ヒトMPZプロモーターを構築し、シュワン細胞特異的高効率発現プロモーターカセットを作成した。不死化シュワン細胞株IMS32あるいはIFRS1を用いたルシフェラーゼ・レポーターアッセイにより最も転写活性が高い配列を選択した。今後、これを用いたAAVベクターの構築を行う。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
技術的に最も困難である適切なプロモータの構築が順調に進んでいるが、一方でCMT1Aモデルマウスの入手とコロニーの構築が計画より遅れているため。
|
| Strategy for Future Research Activity |
本年度、シュワン細胞特異的に高効率に遺伝子発現を可能にするプロモーターの構築が進んでおり、近日中にこれが完成する見込みである。今後はこれを用いたPMP22を特異的に発現抑制できる人工miRNAの配列をいくつかの候補配列の中から選択し、これを組み込んだAAVベクターを構築する予定である。この配列を選択する際に、ヒト遺伝子とマウス遺伝子との間の完全相同配列を選ぶことで、野生型マウスへの投与実験による遺伝子発現抑制効果の検証が可能になる。これらの検証を実施しつつ、PMP22トランスジェニックマウスへの治療実験の準備を進めていく予定である。
|
| Causes of Carryover |
本年度、導入しコロニー構築予定であったCMT1Aモデルマウスの入手の手配が計画通りに進まなかったため、このための次年度への繰越となった。令和２年度は、このマウスの導入とコロニーの拡大を進める計画であり、次年度使用額はこのための費用として用いる計画である。
|
