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2019 Fiscal Year Research-status Report

細胞認識性エクソソームを用いた臓器線維症に対する革新的治療法の開発

Research Project

Project/Area Number 19K22627
Research InstitutionTokai University

Principal Investigator

稲垣 豊  東海大学, 医学部, 教授 (80193548)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 柳川 享世  東海大学, 医学部, 助教 (10760291)
赤池 敏宏  公益財団法人国際科学振興財団, その他部局等, 主席研究員 (30101207)
後藤 光昭  公益財団法人国際科学振興財団, その他部局等, 主任研究員 (80235001)
Project Period (FY) 2019-06-28 – 2022-03-31
Keywords肝臓学 / 薬物送達
Outline of Annual Research Achievements

エクソソームは細胞外分泌小胞の一部で、体液中を循環することで遠隔臓器の細胞に情報を伝達する天然キャリアーとして注目されている。しかしながら、エクソソーム自体が有する(1) 細胞内取り込み効率の低さ、(2)エクソソーム内包物質のサイトゾル放出性の低さによる効果の減弱、(3)標的細胞以外への送達による副作用の出現、といった問題から、DDSキャリアーとしてのエクソソームの利用には未だ多くの課題が残されている。
本研究は、エクソソームの細胞への取り込みやサイトゾル放出性を向上させるとともに、バイオマテリアル技術を応用して細胞認識性を付加した新規のエクソソームを開発することで、従来の限界を打ち破る創薬の新たな方法論を提案することを目的としている。研究初年度となる2019年度は、薬物送達モニタリング用エクソソームの開発を行い、以下の知見を得た。
1)ホタル・ルシフェラーゼをエクソソーム内包タンパク質として培養液中に高効率に分泌するため、同ルシフェラーゼ遺伝子とエクソソーム指向性タグとを連結した発現プラスミドを作製した。この際、ルシフェラーゼ遺伝子独自のコザック配列と転写開始部位を欠損させることで、トランスフェクションされたHEK293細胞の培養上清中エクソソーム分画のルシフェラーゼ活性は約2倍に増加した。
2)同様に、mCherry とEGFPとの連結分子をエクソソーム内包タンパク質として培養液中に分泌するエクソソーム誘導性の発現プラスミドを作製し、これをHEK293細胞にトランスフェクションすると、同細胞の細胞質と分泌エクソソーム中には黄色蛍光を呈する融合タンパク質が確認され、これを取り込んだ初代培養肝細胞の細胞質内にはpHの低下に伴って黄色または赤色の蛍光を有する粒子が検出された。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

取り込み効率の定量評価に有用なホタル・ルシフェラーゼ搭載エクソソーム、ならびに取り込んだエクソソームのエンドソームからサイトゾルへの放出を確認するためのmCherry/EGFPエクソソームの産生系を確立したことで、次年度以降に予定しているエクソソームの修飾による薬物送達能の改善が評価可能となった。

Strategy for Future Research Activity

前年度に作製したモニタリングエクソソームを用いて、薬物送達の改善に向けて以下の実験を行う。
1)ホタル・ルシフェラーゼ搭載エクソソームに、細胞への取り込みを増強させる目的でカチオン性脂質の DOTAPを混合後に細胞培養上清に添加し、ルシフェラーゼアッセイにより細胞への取り込み効率の改善を評価する。
2)エクソソーム内包タンパク質のサイトゾル放出性を高めるために、pH感受性膜融合ペプチドを用いた検討を行う。この際、EGFP蛍光のpH依存性を利用して、mCherryとの共発現の有無によりエクソソーム内包タンパク質のサイトゾル放出を評価して、上述したpH感受性膜融合ペプチドの有用性を検証する。

Causes of Carryover

(理由)研究初年度においては、樹立細胞株であるHEK293細胞を用いたエクソソーム産生系の確立に多くの時間を割いたため、エクソソームの取り込み側である初代培養肝細胞を得るためのマウスや細胞分離試薬の購入に予定経費を全額使用するには至らなかった。
(使用計画)次年度からは、初代培養肝細胞を用いた取り込み効率や細胞内局在の検討が本格化するため、上述したマウスや肝細胞分離試薬・培養関連機材の購入が予定されている。

  • Research Products

    (17 results)

All 2020 2019 Other

All Journal Article (8 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Peer Reviewed: 6 results,  Open Access: 3 results) Presentation (7 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results) Remarks (2 results)

  • [Journal Article] A Deactivation Factor of Fibrogenic Hepatic Stellate Cells Induces Regression of Liver Fibrosis in Mice2020

    • Author(s)
      Nakano Yasuhiro、Kamiya Akihide、Sumiyoshi Hideaki、Tsuruya Kota、Kagawa Tatehiro、Inagaki Yutaka
    • Journal Title

      Hepatology

      Volume: 71 Pages: 1437~1452

    • DOI

      10.1002/hep.30965

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] 肝線維化研究の進歩と臨床展開2020

    • Author(s)
      稲垣 豊
    • Journal Title

      日本消化器病学会雑誌

      Volume: 117 Pages: 9~19

    • DOI

      10.11405/nisshoshi.117.9

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Gli signaling pathway modulates fibroblast activation and facilitates scar formation in pulmonary fibrosis2019

    • Author(s)
      Tsukui Tatsuya、Ueha Satoshi、Shichino Shigeyuki、Hashimoto Shinichi、Nakajima Takuya、Shiraishi Kazushige、Kihara Miho、Kiyonari Hiroshi、Inagaki Yutaka、Matsushima Kouji
    • Journal Title

      Biochemical and Biophysical Research Communications

      Volume: 514 Pages: 684~690

    • DOI

      10.1016/j.bbrc.2019.05.011

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] CD103hi Treg cells constrain lung fibrosis induced by CD103lo tissue-resident pathogenic CD4 T cells2019

    • Author(s)
      Ichikawa Tomomi、Hirahara Kiyoshi、Kokubo Kota、Kiuchi Masahiro、Aoki Ami、Morimoto Yuki、Kumagai Jin、Onodera Atsushi、Mato Naoko、Tumes Damon J.、Goto Yoshiyuki、Hagiwara Koichi、Inagaki Yutaka、Sparwasser Tim、Tobe Kazuyuki、Nakayama Toshinori
    • Journal Title

      Nature Immunology

      Volume: 20 Pages: 1469~1480

    • DOI

      10.1038/s41590-019-0494-y

    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Upregulation of cancer-associated gene expression in activated fibroblasts in a mouse model of non-alcoholic steatohepatitis2019

    • Author(s)
      Asakawa Masahiro、Itoh Michiko、Suganami Takayoshi、Sakai Takeru、Kanai Sayaka、Shirakawa Ibuki、Yuan Xunmei、Hatayama Tomomi、Shimada Shu、Akiyama Yoshimitsu、Fujiu Katsuhito、Inagaki Yutaka、Manabe Ichiro、Yamaoka Shoji、Yamada Tetsuya、Tanaka Shinji、Ogawa Yoshihiro
    • Journal Title

      Scientific Reports

      Volume: 9 Pages: 19601

    • DOI

      10.1038/s41598-019-56039-0

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Intrinsic Control of Surface Immune and Epithelial Homeostasis by Tissue-Resident Gut Stromal Cells2019

    • Author(s)
      Kurashima Yosuke、Tokuhara Daisuke、Kamioka Mariko、Inagaki Yutaka、Kiyono Hiroshi
    • Journal Title

      Frontiers in Immunology

      Volume: 10 Pages: 01281

    • DOI

      DOI:10.3389/fimmu.2019.01281

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] 肝星細胞の脱活性化機構と肝線維化治療への応用2019

    • Author(s)
      中野泰博、稲垣 豊
    • Journal Title

      細胞

      Volume: 51 Pages: 493~496

  • [Journal Article] 肝線維化治療薬開発の現状と課題2019

    • Author(s)
      柳川享世、稲垣 豊
    • Journal Title

      肝胆膵

      Volume: 79 Pages: 897~904

  • [Presentation] 造血系細胞が分泌するエクソソームを介した肝発生と傷害肝修復の制御機構 シンポジウム「エクソソームを介した肝病態の制御機構」2019

    • Author(s)
      柳川享世、住吉秀明、中尾祥絵、松木勇樹、紙谷聡英、近田裕美、大塚正人、三浦浩美、横森昭弘、高木孝士、稲垣 豊
    • Organizer
      第26回肝細胞研究会
  • [Presentation] 効率性と安全性に優れた新規修飾型エクソソームの開発と薬物送達手段への応用2019

    • Author(s)
      松木勇樹、住吉秀明、柳川享世、中野泰博、後藤光昭、赤池敏宏、稲垣 豊
    • Organizer
      第26回肝細胞研究会
  • [Presentation] 肝実質細胞と造血系細胞とのクロストークを介した肝発生と傷害肝修復の制御機構 ワークショップ10「肝構成細胞の病態生理:基礎的研究の臨床応用」2019

    • Author(s)
      柳川享世、住吉秀明、紙谷聡英、横森弘昭、稲垣 豊
    • Organizer
      第55回日本肝臓学会総会
  • [Presentation] Opioid growth factor receptor-like 1; an extracellular vesicle-derived common mediator of regeneration of fibrotic liver and fetal development of hepatic progenitor cells in mice.2019

    • Author(s)
      Takayo Yanagawa, Hideaki Sumiyoshi, Sachie Nakao, Hiromi Miura, Masato Otsuka, Hiromi Chikada, Akihide Kamiya, Hiroaki Yokomori, Takashi Takaki, Yutaka Inagaki
    • Organizer
      20th International Symposium on Cells of the Hepatic Sinusoid
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Clinical significance of a novel exosomal protein, opioid growth factor receptor-like 1 in the repair from liver injury/fibrosis.2019

    • Author(s)
      Takayo Yanagawa, Sachie Nakao, Akihide Kamiya, Hideaki Sumiyoshi, Yuki Matsui, Kota Tsuruya, Tatehiro Kagawa, Isao Okazaki, Yutaka Inagaki
    • Organizer
      70th Annual Meeting of the American Association for the Study of Liver Diseases
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] エクソソーム内包タンパク質Opioid growth factor receptor like-1を介した肝発生と再生の制御機構2019

    • Author(s)
      柳川享世、中尾祥絵、住吉秀明、松木勇樹、岡崎 勲、横森弘昭、稲垣 豊
    • Organizer
      第33回肝類洞壁細胞研究会学術大会
  • [Presentation] 効率性と安全性に優れたエクソソーム治療法の創生に向けたモニタリング用エクソソームの開発2019

    • Author(s)
      松木勇樹、住吉秀明、柳川享世、安田純平、中野泰博、後藤光昭、赤池敏宏、稲垣 豊
    • Organizer
      第33回肝類洞壁細胞研究会学術大会
  • [Remarks] 東海大学大学院 マトリックス医学生物学センター

    • URL

      http://matrix.med.u-tokai.ac.jp/index.html

  • [Remarks] 東海大学大学院 医学研究科

    • URL

      http://www.med.u-tokai.ac.jp/daigakuin/web/matrix.html

URL: 

Published: 2021-01-27  

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