分解後プロテオミクス：法医学からの新規プロテオミクス

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K22756
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 石井 晃 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (30252175)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 名取 雄人 名古屋大学, 医学系研究科, 助教 (80610104)
• Project Period (FY): 2019-06-28 – 2022-03-31
• Keywords: 法医学 / 法医鑑定 / 法医生化学 / ペプチド分析 / 質量分析

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、質量分析法を用いたペプチド解析を行うことにより、最初はトリプシン消化フラグメントを用いて、従来の法医生化学検査では測定不能であった試料における目的タンパクを定量し、次いで、実検体で切断されているペプチドフラグメントを同定し、法医診断に資するタンパク(ペプチド)マーカーの探索を行うことを目的とする。対象となるタンパクとしては、熱中症で上昇するミオグロビン、心不全で上昇するNT-proBNPが挙げられる。
本年度は、尿中ミオグロビンのウェスタンブロッティング解析の予備検討を行った。ブランク尿に終濃度が0, 1, 2.5, 5, 10 ng/mLになるようにヒト組み換えミオグロビンを添加し、これら添加尿サンプル250 microLにアセトニトリル1 mLを加えて20秒間vortexを行い、その後遠心し、これを二回繰り返し、沈殿を採取した。条件1(アセトニトリル沈殿法）は、再溶解した沈殿をそのままサンプルバッファーに溶解し、SDS-PAGEによる電気泳動を行った。条件2（免疫沈降法）は、ウサギ抗ミオグロビン抗体をマイクロビーズにリンクさせたものを、再溶解した沈殿と反応させ、SDS-PAGEを行った。さらにウェスタンブロットで解析したところ、いずれの方法でもミオグロビンは検出されたものの、検出限界は、アセトニトリル沈殿法では1 ng/mLであったのに対し、免疫沈降法では、5 ng/mLと低かった。ただし、免疫沈降法の場合、不純物の多い尿では有利になる可能性があり、今後実試料の分析を行う予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本年度は、コロナ禍による登校制限などが重なり、実験が遅延したため。

Strategy for Future Research Activity

今後、ミオグロビンの免疫沈降による精製及び、ペプチド解析条件の最適化を進める。また、実験助手を導入して実験を進める。

Causes of Carryover

この予算は、ペプチド合成のために使用する予定であったが、最適化が終了せず、次年度使用することとした。今後、ペプチド合成等に用いる他、加えて実験をより迅速に進めるため、実験助手の雇用にあてることとした。