2020 Fiscal Year Research-status Report
植物と病原菌間における細胞間コミュニケーションの分子機構の解明
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19K24688
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| Research Institution | Setsunan University |
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Principal Investigator |
田中 茂幸 摂南大学, 農学部, 講師 (30785481)
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2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | トウモロコシ黒穂病菌 / 細胞外小胞 / エクソソーム / 膜タンパク質 / ノンコーディングRNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度においては、トウモロコシに寄生する病原糸状菌であるトウモロコシ黒穂病菌から細胞外小胞を回収し、内部に含まれる分子を同定し、寄生性への関与を調べた。
まず、植物細胞との相互作用に関わると推定される細胞外小胞上の膜タンパク質を同定するため、プロテオミクス解析を行った。その結果、複数種の機能未知膜タンパク質が存在することがわかった。機能未知タンパク質の一つについて遺伝子破壊株を作出したところ、病原性が低下していた。このことから、細胞外小胞上の膜タンパク質は、病原性に関与することが示唆された。その他の膜タンパク質についても、病原性への関与を検討するため、遺伝子破壊株の作出を試みている。
さらに、細胞外小胞内に含まれるRNAを同定するため、ポリA鎖/非ポリA鎖の両者を対象にRNA-seq解析を行った。その結果、細胞外小胞には多くのRNAが含まれていることがわかった。興味深いことに、細胞外小胞にはノンコーディングRNAが濃縮されていることが分かった。これらノンコーディングRNAはゲノム上の遺伝子間領域に由来し、配列は黒穂病菌間で保存されているケースが見られた。ノンコーディングRNA欠損株を作出すると、病徴に変化が見られたことから、細胞外小胞に含まれるノンコーディングRNAが病原性に重要な役割を果たす可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
令和2年度における当初の研究計画では、細胞外小胞のプロテオーム解析を行い、細胞外小胞に含まれる膜タンパク質を同定し、遺伝子破壊株を作出することが目標であった。これらの実験を実際に行い、植物への寄生性に低下がみられる破壊株が既に得られたことから、計画していた内容を達成したと言える。
また、植物細胞に細胞外小胞を与えた時の動態を、顕微鏡で観察した。細胞外小胞の膜を蛍光色素で染色し、植物細胞と共に培養すると、一定時間後に、植物細胞膜全体が強く染色されることが分かった。このことは、細胞外小胞が植物細胞膜と融合したことを示唆している。この結果から、病原糸状菌由来の細胞外小胞に含まれる内容物は、細胞外小胞と植物細胞膜の膜融合を介して輸送されている可能性を提示している。
最期に、細胞外小胞に含まれるRNAについてRNA-seqを利用した解析を行った。当初の研究計画ではRNA解析を計画していなかったが、動物細胞における研究例では細胞外小胞内のRNA研究が注力されていることから、解析を行うこととした。結果、病原糸状菌由来の細胞外小胞にはノンコーディングRNAが濃縮されていることがわかり、またこのノンコーディングRNAが植物への寄生性に関与する結果が得られたことから、「細胞外小胞に含まれるノンコーディングRNAと植物寄生性」という新たな研究テーマを創出できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和3年度では、細胞外小胞の他の膜タンパク質変異体を作出し、病原性への寄与を調べる予定である。また、膜タンパク質変異体由来の細胞外小胞が、植物細胞に取り込まれるかどうかを、顕微鏡を用いて観察する。また、膜タンパク質変異体が植物寄生の際にどのような表現型を示すか、顕微鏡解析や、植物防御遺伝子応答をRNA-seqによる発現解析で調べる。
細胞外小胞に含まれるノンコーディングRNAに関しては、本研究とは別プロジェクトとして遂行する予定である。
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| Causes of Carryover |
初年度に博士研究員を採用する計画をしており公募を行ったが、適任者が見つからなかったため、その予算を次年度に繰り越すことになった。次年度ではその予算を用いて、研究補助員を2名採用している。
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