2020 Fiscal Year Research-status Report
Design of beta-barrel type transmembrane protein complex by combination of computational and experimental studies
| Project/Area Number |
19KK0178
|
|---|
| Research Institution | Tohoku University |
|---|
Principal Investigator |
田中 良和 東北大学, 生命科学研究科, 教授 (20374225)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山下 恵太郎 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 客員共同研究員 (20721690)
松浦 友亮 大阪大学, 工学研究科, 招へい教授 (50362653)
喜多 俊介 北海道大学, 薬学研究院, 特任助教 (10702003)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-10-07 – 2023-03-31
|
| Keywords | 膜孔形成毒素 / 電子顕微鏡 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
膜孔形成毒素は標的細胞の細胞膜に膜孔を形成する。膜孔は原子レベルで正確なナノメートルオーダーの孔（ナノポア）であり、これを利用した分子センサーが開発されている。更なる分子センサーの開発のために、目的に応じたサイズ・形状のナノポアを自在に作成できる技術が必要となる。本研究では、実験と計算科学を併用して膜孔のデザインを実現し、任意の分子特性のナノポアを作り出すことを目指す。
本研究では黄色ブドウ球菌の膜孔形成毒素に着目して分子デザインを実施する。黄色ブドウ球菌の膜孔形成毒素は、2種類に分類される。1つはホモ7量体の膜孔を形成するアルファヘモリジン、もう一方は、2種類の異なるポリペプチド（LukF、Hlg2）が4分子ずつ会合してヘテロ8量体の膜孔を形成するガンマヘモリジンである。本研究では、アルファヘモリジンとガンマヘモリジンの立体構造情報に基づき、10種類以上のキメラタンパク質を設計・調製し、その分子特性を評価した。2020年度はアルファヘモリジンの膜外ドメインと、LukF、Hlg2の膜貫通領域を融合した各種変異体を調製し、溶血活性試験、SDS-PAGE、電子顕微鏡解析により活性評価を行った。アルファヘモリジンとLukFのキメラ変異体（AF変異体）はドメイン同士の連結部分の配列を調整することにより高活性の分子を取得することができた。一方で、アルファヘモリジンとHlg2のキメラ変異体（AG変異体）では、いずれの変異体も溶血活性を有する分子を取得することはできなかった。これらの変異体の比較から、安定な膜孔構造を形成するには、膜貫通領域のみならず連結部分の柔軟性も視野に入れて分子設計する必要性が示唆された。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
アルファヘモリジンの膜外ドメインとLukFおよびHlg2の膜貫通領域から構成される複数のキメラタンパク質の発現系を構築したが、いずれのキメラタンパク質も沈殿しやすい不安定な分子であった。そこで、まず、精製の条件を精査し、添加剤を調整することで可溶性の単量体として安定な分子を調製する系を構築できた。得られたタンパク質を用いて、溶血活性、会合体形成活性を評価したところアルファヘモリジンとLukFのキメラタンパク質（AF変異体）は強い溶血活性を有していたのに対し、アルファヘモリジンとHlg2のキメラタンパク質（AG変異体）には溶血活性がみられなかった。そこで、これらのキメラタンパク質の機能の違いを評価した。SDS-PAGEによる解析の結果、いずれの変異体も自己会合して安定な膜孔構造を形成できることがわかった。また、電子顕微鏡単粒子解析からは、AF変異体もAG変異体も自己会合できることがわかった。以上の結果から、AG変異体は膜孔様の会合構造は形成できるものの、細胞膜にポアを形成できるだけの安定な膜貫通領域の会合構造を形成できないことが示唆された。
|
| Strategy for Future Research Activity |
AF変異体のいくつかは強い溶血活性が確認されたが、AG変異体はいずれも溶血活性を示さなかった。これらの変異体はいずれも会合体を形成することがわかったため、今後は、溶血活性の有無がどのような会合構造の違いに起因するのかを構造生物学的側面から解析する。また、他のキメラ分子によるシナジー効果についても評価し、得られる情報を新たな変異体のデザインへと応用する。
|
| Causes of Carryover |
コロナウイルス感染拡大の影響で予定していた海外出張ができなかったため次年度使用額が生じた。コロナウイルス終息後に海外の大学にて研究を実施するために使用する計画である。
|
