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2008 Fiscal Year Annual Research Report

細菌性コラゲナーゼの基質結合ドメインを用いた薬物送達システムの開発型研究

Research Project

Project/Area Number 20590452
Research InstitutionKitasato University

Principal Investigator

松下 治  Kitasato University, 医学部, 教授 (00209537)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 玉井 栄治  松山大学, 薬学部, 准教授 (40333512)
小出 隆規  早稲田大学, 先進理工学部, 教授 (70322253)
宮田 茂  香川大学, 医学部, 講師 (90314913)
Keywordsガス壊疽菌群 / コラゲナーゼ / コラーゲン結合ドメイン / スピン標識ペプチド / 表皮成長因子 / 重層扁平上皮 / 人工皮膚 / 再生医療
Research Abstract

ガス壊疽菌群のコラゲナーゼのC末端にはコラーゲン結合ドメイン(CBD)が共通に存在している。CBDは不溶性のコラーゲン細繊維に本酵素をアンカーリングするのに役立つと考えられた。CBDは結晶学的解析によりβサンドイッチ構造をとりCa結合部位を持つことが示された。また部位特異的突然変異によりCBDはサンドイッチの側面でコラーゲンに結合すると考えられた。
今回は分子ドッキングにより示された3種類の基質結合モデルの内いずれが正しいかを、コラーゲン様ペプチドを用いたNMR perturbaton assayにより検討した。N末端スピン標識ペプチドでは非標識ペプチドによる変化に加えCa結合部位から離れた部位のシグナルが消失した。C末端標識ペプチドではCa結合部位近傍のシグナルが消失した。基質ペプチドはβサンドイッチの側面に、βストランドに直行する方向で、C末端がCa結合部位に向いて結合すると考えられた。小角X線回折により水溶液中のCBD-基質複合体の立体構造を決定したところ、CBDは基質分子のC末端近傍に結合していると推定された。
線維芽細胞とアテロコラーゲンを含む溶液を生体親和性メッシュを通して還流し、メッシュの上に高密度の人工結合組織を形成した。これを表皮成長因子(EGF)-CBD融合タンパク質と表皮細胞を含む培養液で覆って24時間静置後、通常の培養液に置換して14日間培養した。線維芽細胞とコラーゲン細線維からなる人工真皮層の上に、重層扁平上皮からなる人工表皮層が形成され、その上層部は角化していた。有蕀層では正常皮膚に比較して少ないながらもデスモゾームが形成されていた。表皮の基底細胞下には不連続ながら基底板が形成されていた。細胞外マトリックスに特定の機能を持たせて得られる積層型人工組織は基礎医学研究および再生医療分野で種々の応用が可能であると思われる。

  • Research Products

    (5 results)

All 2009 2008

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results) Presentation (2 results) Patent(Industrial Property Rights) (1 results)

  • [Journal Article] High-level expression of his-tagged clostridial collagenase in Clostridium perfringens.2008

    • Author(s)
      Tamai, E., Miyata, S., Tanaka, H., Nariya, H., Suzuki, M., Matsushita, O., Hatano, N., Okabe, A.
    • Journal Title

      Appl. Microbiol. Biotechnol. 80

      Pages: 627-635

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] ^1H,^<13>C and ^<15>N resonace assignments of Ca^<2+> bound collagen-binding domain derived from a clostridial collagenase2008

    • Author(s)
      Philominathan, S. T. L., Matsushita, O., Jordan, J. B., Sakon, J.
    • Journal Title

      Biomol. NMR Assign. 2

      Pages: 127-129

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] ガス壊疽菌群コラゲナーゼの基質認識機構と再生医学への応用2009

    • Author(s)
      松下治、小出隆規、安達栄治郎
    • Organizer
      第82回日本細菌学会総会
    • Place of Presentation
      愛知県名古屋市
    • Year and Date
      2009-03-12
  • [Presentation] ガス壊疽菌群コラゲナーゼのセグメント2の構造解析2008

    • Author(s)
      松下治
    • Organizer
      第91回日本細菌学会関東支部総会
    • Place of Presentation
      千葉県長生郡長塚町
    • Year and Date
      2008-10-23
  • [Patent(Industrial Property Rights)] 積層型高密度培養人工組織の製造方法及び積層型高密度培養人工組織2009

    • Inventor(s)
      安達栄治郎, 松下治, 岩城啓修, 細谷 智, 西 望
    • Industrial Property Rights Holder
      学校法人北里研究所, 国立大学法人香川大学
    • Industrial Property Number
      特願2009-17475
    • Filing Date
      2009-01-19

URL: 

Published: 2010-06-11   Modified: 2016-04-21  

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