2008 Fiscal Year Annual Research Report
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20591638
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| Research Institution | Tokyo Women's Medical University |
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Principal Investigator |
太田 岳洋 Tokyo Women's Medical University, 医学部, 助教 (70203792)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
林 和彦 東京女子医科大学, 医学部, 准教授 (10208613)
中村 努 東京女子医科大学, 医学部, 講師 (30198220)
倉持 英和 東京女子医科大学, 医学部, 助教 (30287362)
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| Keywords | 胆道癌 / CTC / バイオマーカ |
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| Research Abstract |
はじめに、本計画に特化したプロトコールを作製するために、上皮系培養細胞(大腸癌培養細胞)を用いて予備実験を行った。
具体的な方法としては、健常人の末梢血を採取し、その一部存大腸癌細胞株HCT116と混和した後、直ちにリンパ球分離液を使用して単核球分画を分離・採取した。冷メタノールで固定した後洗浄し、リンパ球表面抗原を認識する抗体を用いてNegative Selectionを行い、さらに上皮系の細胞を認識するMOC31抗体をコートした磁性ビーズを使用して陽性細胞を抽出した。ビーズに付着した細胞をスライドグラスに塗沫し、FITC 標識した抗cytokeratin抗体およびHoechst33258を反応させて蛍光染色し、両方が陽性である細胞を癌細胞と判定した。残りの未梢血から同様に単核球分画を採取し、培養細胞を混入しなかったものを陰性コントロールとして使用した。手法を少しずつ調整していき、これらから実際に癌細胞がこの方法で採取できることを確認することができた。
次に、同様のサンプルから塗沫標本を作製し.抗Cytokeratin抗体を用いた免疫染色を行い、その陽性細胞をMicrodissectionで特異的に採取した。採取した細胞からtotal RNAを抽出し、cDNAを合成しReal-Time quantitative PCR法で遺伝子発現を測定した.数種類の清伝子については発現測定に成功しているが,蛍光染色に比べて免疫染色が洗浄操作などのステップが多く煩雑であることから、多くの細胞成分かスライド上から脱落してしまい、最終的にうまく採取できるものはごくわずかになってしまう問題点が発覚した。現在もプロトコール改良を鋭意行っているところである。
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