2009 Fiscal Year Annual Research Report
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20591638
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| Research Institution | Tokyo Women's Medical University |
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Principal Investigator |
太田 岳洋 Tokyo Women's Medical University, 医学部, 講師 (70203792)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
林 和彦 東京女子医科大学, 医学部, 准教授 (10208613)
中村 努 東京女子医科大学, 医学部, 講師 (30198220)
倉持 英和 東京女子医科大学, 医学部, 助教 (30287362)
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| Keywords | 胆道癌 / CTC / Biomarker |
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| Research Abstract |
前年度に行ったCirculating Tumor Cells (CTC)の検出のためのプロトコールを改善すべく予備実験を行った。前年度と同様の方法で末梢血中の癌細胞の検出は可能であり、そこからLaser Capture Micxodissectionを用いて採取されたサンプルからの遺伝子発現測定は可能であったが、採取するサンプル量が少ない場合や発現量の低い遺伝子は測定が困難であった。実際の癌患者におけるCTCは極めて少数のみ存在するという報告があるため、極少量のサンプルからの遺伝子発現の検出が可能となる方法を検討した。
採取したサンプルはアルコールにて固定され、常温にて免疫染色の過程を経るため、メッセンジャーRNAはdegradationしているものと考えられる。degradationの程度がさらに強いと考えられるホルマリン固定パラフィン包埋標本から抽出したtotal RNAの濃度をNanoDropで測定し、一定量のRNAから相補的DNAを作成、TaqMan[○!R] PreAmp Master Mix (Applied Biosystems)を用いてプロトコール通りに相補的DNAを前増幅した後、その一部を用いてReal-Time PCR法にて数種類の異なる遺伝子の発現測定を行った。前増幅処理をしたサンプルと処理をせず相補的DNAから直接Real-TimePCR法にて遺伝子発現測定を行ったものとの遺伝子発現量を比較し、発現パターンを検討したところ、前増幅したものとしていないものとの発現パターンは同様であった。また、サンプルから抽出したtotal RNAの濃度が約25ng/μL以下であると前増幅をしても発現測定が困難となることもわかった。このデータおよび手法を応用することでCTCのような極めて少量のサンプルからでも正確な発現比較研究が可能となることが示唆された。
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