ROBO4プロモーターの転写制御機構の解明とウイルスベクターへの応用

2008 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20790064
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 岡田 欣晃 Osaka University, 薬学研究科, 助教 (50444500)
• Keywords: 血管内皮細胞 / Robo4遺伝子 / 組織特異性 / Hprtターゲティング法

Research Abstract

我々は血管内皮細胞特異的に遺伝子が発現するメカニズムを明らかにするため、Robo4遺伝子の発現制御機構の解析を行っている。これまでに、Robo4プロモーター中の-119 ETSサイトに転写因子GABPが結合し、転写を活性化することをゲルシフトアッセイ、クロマチン免疫沈降法、ルシフェラーゼアッセイ等の手法を用いて明らかにしてきた。今回我々は、このETSサイトがin vivoにおいてもRobo4の発現制御に重要な配列であることを、遺伝子改変マウスを用いて明らかにしようと考えた。まず、Robo4プロモーターのETSサイトに変異を加え、これにLacZ遺伝子を連結した。次に、このトランスジーン1コピーを相同組換え法を用いて、マウスES細胞のHprt遺伝子座上流に挿入し、得られたES細胞を用いてトランスジェニックマウスの作製を行った。このマウスと、以前に作成した天然型Robo4プロモーターを持つマウスにおける、LacZの発現を比較したところ、天然型のRobo4プロモーターを持つマウスでは、全ての臓器において血管内皮細胞特異的にLacZが発現しているのに対し、ETSサイトに変異を持つマウスでは、LacZの発現が大幅に減少していることが明らかとなった。また、マウスRobo4遺伝子をLacZに置換したノックインマウスと、このマウスのETSサイトに変異を加えたマウスを用いて同様の実験を行ったところ、血管内皮細胞特異的であったLacZの発現は、ETSサイトへの変異導入により大きく減少した。これらの結果から、Robo4プロモーターのETSサイトは、in vivoにおいても転写活性に重要性な配列であることが明らかとなった。本成果は、生理的条件下に最も近いプロモーター解析法を提唱するものであり、エピジェネティックな転写制御研究など、今後の転写研究の有用なツールとなると考えられる。

Research Products

• [Journal Article] Ligand-independent assembly of purified soluble magic roundabout (Robo4), a tumor-specific endothelial marker (2008)
  • Author(s): Yoshikawa M, Mukai Y, Okada Y, Yoshioka Y, Tsunoda S, Tsutsumi Y, Okada N, Aird WC, Doi T, Nakagawa S.
  • Journal Title: Protein Expr Purif 61 Pages: 78-82
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A GABP-binding element in the Robo4 promoter is necessary for endothelial expression in vivo (2008)
  • Author(s): Okada Y, Jin E, Nikolova-Krstevski V, Yano K, Liu J, Beeler D, Spokes K, Kitayama M, Funahashi N, Doi T, Janes L, Minami T, Oettgen P, Aird WC.
  • Journal Title: Blood 112 Pages: 2336-9
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Elevated levels of placental growth factor represent an adaptive host response in sepsis (2008)
  • Author(s): Yano K, Okada Y, Beldi G, Shih SC, Bodyak N, Okada H, Kang PM, Luscinskas W, Robson SC, Carmeliet P, Karumanchi SA, Aird WC.
  • Journal Title: J Exp Med 205 Pages: 2623-31
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 血管内皮細胞に発現するレセプターROBO4のリガンドの同定 (2009)
  • Author(s): 蒋志侠, 舟橋伸昭, 加納義浩, 成瀬啓樹, 岡田欣晃, 土井健史
  • Organizer: 日本薬学会第129年会
  • Place of Presentation: 京都
  • Year and Date: 2009-03-27
• [Presentation] 血管内皮細胞と非血管内皮細胞におけるROBO4プロモーターのメチル化パターンの相違 (2009)
  • Author(s): 加納義浩、舟橋伸昭、成瀬啓樹、蒋志 侠、岡田欣晃、土井健史
  • Organizer: 日本薬学会第129年会
  • Place of Presentation: 京都
  • Year and Date: 2009-03-26
• [Presentation] Difference of the methylation pattern of the Robo4 promoter between endothelial cell and non-endothelial cell (2008)
  • Author(s): Yoshiaki Okada, Nobuaki Funahashi, Yoshihiro Kano, Hiroki Naruse, Zhixia Jiang, Enjing Jin, kiichiro Yano, William Aird, Takefumi Doi
  • Organizer: The 6^<th> Korea-Japan Joint Symposium on Vascular Biology and The 16th Annual Meeting of the Japan Vascular Biology and Medicine Organization JOINT MEETING
  • Place of Presentation: 金沢
  • Year and Date: 20081203-05
• [Presentation] 血管内皮細胞と非血管内皮細胞におけるROBO4プロモーターのDNAメチル化状態の相違 (2008)
  • Author(s): 舟橋伸昭、成瀬啓樹、加納義浩、Zhixia Jiang、岡田欣晃、土井健史
  • Organizer: 第81回日本生化学会大会第31回日本分子生物学会年会合同大会(BMB2008)
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2008-12-11
• [Presentation] 新規血管内皮細胞マーカーRobo4のin vivo発現制御機構解析 (2008)
  • Author(s): 岡田欣晃、金恩京、北山美絵、舟橋伸昭、矢野喜一郎、William Aird、土井健史
  • Organizer: 第81回日本生化学会大会第31回日本分子生物学会年会合同大会(BMB2008)
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2008-12-11
• [Remarks]
  • URL: http://www.phs.osaka-u.ac.jp/homepage/b018/