2020 Fiscal Year Annual Research Report
Development of the next-generation high-speed AFM and detailed dynamic behavior analysis of biomolecules
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20H00327
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
古寺 哲幸 金沢大学, ナノ生命科学研究所, 教授 (30584635)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 原子間力顕微鏡 / 生物物理学 / タンパク質 / 一分子イメージング / 生体分子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
高速原子間力顕微鏡（高速AFM）による観察可能な生命現象の広範化を図ることを目指して、現在の高速AFMの時間分解能を律するデバイス群を大幅に改良し、次世代型高速AFMの研究開発することを推進している。本年は、高速振幅計測器を改良し、1 MHzのカンチレバーを用いた場合、従来型の7倍高速化することに成功した。また、集積イオンビーム装置を用いて高速微小カンチレバーに追加工することで、超小型高速カンチレバーの開発を進めた。その結果、水溶液中で10MHzの共振周波数をもつカンチレバーを開発することができた。また、開発した微小カンチレバーの変位検出光学系の開発に取り組み、小さなレーザースポットサイズと良好なS/Nを持った光学系の開発を進めた。開発した超微小カンチレバーと光学系を組み合わせた顕微鏡システムで、脆い生体分子複合体であるアクチンフィラメントを開発したところ、50 ms/frameといった高いフレームレートでもフィラメントを壊さずに観察することに成功した。超微小カンチレバーは高いバネ定数を持つため、生体試料を壊しやすいことが懸念されていたが、それほど大きな障害にならないことが判明した。
また、開発途中の次世代型高速ＡＦＭを用いて、バイオ応用研究を進めた。たとえば、これまで静的な構造生物学的手法では可視化することが困難だったリボソームのストークを直接的に可視化することに成功し、ストークが少なくとも2状態のコンフォメーションをとることを見出した。さらに、ストークが翻訳因子をその周りにかき集めるファクタープール仮説というものが提唱されていたが、高速ＡＦＭ観察により、その実態を初めて可視化することに成功した。これにより開発した顕微鏡装置の性能を示すとともに、生物学的に意義深い新知見を得ることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現在の高速AFMの時間分解能を律するデバイス群を大幅に改良し、次世代型高速AFMの研究開発することを推進している。開発すべき要素技術は、①Ｚスキャナー、②デュアルＺスキャナーシステム、③カンチレバーの振動振幅計測回路、④超微小カンチレバー、⑤超微小カンチレバー用の変位検出系であり、これらを全て高速化・高S/N化することで、装置のZ方向の力制御に関わる周波数帯域（fB）の向上を図る。これまでに①、③、④、⑤に関する開発については、技術的に困難だった大きなハードルを概ね越えたといえる。特に、作成した超微小カンチレバーは高いバネ定数を持つため、生体試料を壊しやすいことが懸念されていたが、それほど大きな障害にならないことが判明したことは、今後の開発指針を考えるうえで大きな成果であると考える。このことは、さらに小型の微小カンチレバーの開発が可能であることを示唆しており、当初設定していたイメージングレートを上回る走査性能を持った高速AFM装置ができることが予想される。②については、回路シミュレーターを用いたシミュレーション実験を行い、原理的に実現可能であるというところまで確認している。
また、開発途中の次世代型高速ＡＦＭを用いて、いくつかのタンパク質系でバイオ応用研究を進めている。たとえば、アクチン結合タンパク質であるCAP1の複合体構造を明らかにすることや、コフィリンが結合したアクチン線維の末端に結合し、アクチン線維を脱重合する過程が見られつつある。これらの観察データを集積している最中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
開発を進めている要素技術である、①Ｚスキャナー、②デュアルＺスキャナーシステム、③カンチレバーの振動振幅計測回路、④超微小カンチレバー、⑤超微小カンチレバー用の変位検出系のそれぞれの完成度を高めつつ、開発途中の次世代型高速ＡＦＭを用いて、バイオ応用研究を推進していく。①に関しては、1.2MHz程度の共振周波数が既に実現されているが、Ｚスキャナーのバネ定数や質量を電子回路でコントロールすることによって、共振周波数をコントロールし、2 MHz程度までの共振周波数を実現することに本年から取り組む。②については、シミュレーション結果をもとに実機にも応用し、実験的にも実現可能であること立証する。近年の高速AFM関連で特筆すべき技術開発として、金沢大の安藤敏夫グループらによって、Ｘ走査の復路をスキップする新しい走査方法が提案された（Fukuda & Ando, Rev. Sci. Instrum. 2021）。この手法では、画像取得レートを2倍にする効果があるだけでなく、カンチレバーと試料間の相互作用力が小さくなる走査方向があることが提案されている。この技術を取り入れると、目標とするフレームレートを実現するのに必要なZ方向の力制御に関わる周波数帯域（fB）が半分程度でよいことになる。もしくは、当初目標としていたｆＢを実現すれば、目標とするフレームレートを2倍にできることを意味する。導入により、大きな技術的な進展が見込めるため、いち早くその走査方法を導入する。
また、学会や研究会などで積極的に進捗状況を発表し、次世代型高速ＡＦＭ技術に興味を持ってくれた国内外の研究者と共同研究を推進し、一つでも多くの生命現象の詳細解明に寄与できるように努める。
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