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2022 Fiscal Year Annual Research Report

Development of the next-generation high-speed AFM and detailed dynamic behavior analysis of biomolecules

Research Project

Project/Area Number 20H00327
Research InstitutionKanazawa University

Principal Investigator

古寺 哲幸  金沢大学, ナノ生命科学研究所, 教授 (30584635)

Project Period (FY) 2020-04-01 – 2024-03-31
Keywords原子間力顕微鏡 / 生物物理学 / タンパク質 / 一分子イメージング / 生体分子
Outline of Annual Research Achievements

本年は、昨年度までに開発に成功していた高速振幅計測器を実用化するために、広帯域の電子回路の製作得意とする企業とともに更なる広帯域化と操作性を向上させた電子回路を共同開発した。自作したものの帯域の数倍の高速化が見込まれている。また、昨年度までに開発していた超小型高速カンチレバーの変位をより精密に計測するために、変位計測のためのレーザースポットの微小化に取り組んだ。レーザースポット径を精密に計測する手法を開発し、レーザーダイオード、コリメーションレンズ、対物レンズを検討することで、従来のスポット径の21%程度にまでスポット径を微小化することができた。さらに、昨年度までに考案していた逆伝達関数法とアクティブダンピング法を組み合わせた電子回路(共振コントローラー)では、Zスキャナーの共振周波数とQ値を一緒にコントロールできることが実証できたため特許出願を行った(特願2022-141581)。
また、開発途中の次世代型高速AFMを用いて、バイオ応用研究を進めた。たとえば、慢性腎臓病や骨粗鬆症などに関与するビタミン D 代謝酵素の過剰発現を抑えるために、ビタミン D 代謝酵素とDNAアプタマーの複合体の観察に成功した(ACS applied materials & interfaces誌)。また、新規のゲノム編集タンパク質CRISPR-Cas3が、狙ったDNA配列周辺のDNAを大規模に切断する様子の直接観察に成功した(Nat. Commun.誌)。その他にも、微小管結合タンパク質であるEB1とSka1の複合体(J. Biol. Chem.誌)、アクチン結合タンパク質であるRng2がミオシンIIの運動の下げること(Life Science Alliance誌)などを明らかにした。これにより開発した顕微鏡装置の性能を示すとともに、生物学的に意義深い新知見を得ることができた。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

現在の高速AFMの時間分解能を律するデバイス群を大幅に改良し、次世代型高速AFMの研究開発することを推進している。開発すべき要素技術は、①Zスキャナー、②デュアルZスキャナーシステム、③カンチレバーの振動振幅計測回路、④超微小カンチレバー、⑤超微小カンチレバー用の変位検出系である。これらを全て高速化・高S/N化することで、装置のZ方向の力制御に関わる周波数帯域(fB)を現行の装置の約7倍である約500 kHzにまで高めることを目標としていた。①、③、④、⑤に関する開発については、目標性能を達成することができ、①については、電子回路を用いた共振コントローラーの開発にも成功したことで、さらなる高速化が期待される状況である(特願2022-141581)。③については、企業と共同してより高い性能と操作性を持った計測器の開発を進めている。④は微小カンチレバーの変位をより高精度に計測するために、変位計測用のレーザースポットを従来の21%程度までに微小化することに成功した。②は、回路シミュレーターを用いたシミュレーション実験を行い、原理的に実現可能であることが確認できているが、本年度は進めることができなかった。一方で、真核細胞の高速AFM観察の系の立ち上げに成功した。また、開発途中の次世代型高速AFMを用いて、いくつかのタンパク質系でバイオ応用研究も進めている。たとえば、細胞内での機能が良く分かっていないSMCタンパク質について、そのサブ分子形状まで識別しながらDNAと結合する様子を可視化することに成功している。ヌクレオチド条件で結合様式が変化することも見えているため、その分子メカニズムに深く迫れることが期待される。

Strategy for Future Research Activity

高速AFM装置の走査速度を大幅に改良するために、昨年度までに本研究では、1.1 MHz程度の共振周波数を持つ超高速Zスキャナー、共振周波数と共振のQ値をコントロールできるZスキャナー共振コントローラー、カンチレバーの振動振幅を振動周期の5倍程度の速度で計測できる高速振幅計測器、液中で10 MHz程度の共振周波数をもつ超小型カンチレバー、超微小カンチレバーの変位を高精度で検出する光学システム、超微小カンチレバーのための加振システムを開発してきた。本年は、まだ改良の余地がある加振システムをさらに改良することで、超微小カンチレバーを10 MHz程度で安定に加振できるようにする。光学システムでは、カンチレバーの背面に照射するレーザースポット径の面積を従来の21%程度にまで縮小することに成功しているが、レーザー素子や対物レンズの組み合わせを検討することでさらなる縮小化を目指す。また、上記のデバイスを全て搭載した次世代型高速AFMをくみ上げ、フィードバック制御帯域や観察対象への低侵襲性などといった性能の評価を行う。
また、これまで開発してきた最速の高速AFM装置を用いて、バイオ応用研究に取り組む。細胞骨格(アクチン線維や微小管)に結合するタンパク質の動態や、染色体構造メンテナンス(SMC)タンパク質の動態を直接観察することで、それらの機能発現のメカニズムの理解を深める。特に、SMタンパク質では、分子のドメイン構造を識別しながらDNAと結合している様子や、DNAとの結合様式がヌクレオチドに依存して変化することを見出すことに成功しているので、重点的に研究を推進し、分子の機能メカニズムの詳細に迫る。また、真核細胞表面を高速AFM観察し、膜表面のタンパク質や脂質の形状動態を高時間・高空間分解能で得ることで、それらの実体を明らかにすることを目指す。

  • Research Products

    (27 results)

All 2023 2022 Other

All Int'l Joint Research (2 results) Journal Article (12 results) (of which Int'l Joint Research: 4 results,  Peer Reviewed: 12 results,  Open Access: 11 results) Presentation (8 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results,  Invited: 2 results) Remarks (4 results) Patent(Industrial Property Rights) (1 results)

  • [Int'l Joint Research] IISER Thiruvananthapuram(インド)

    • Country Name
      INDIA
    • Counterpart Institution
      IISER Thiruvananthapuram
  • [Int'l Joint Research] Emory University(米国)

    • Country Name
      U.S.A.
    • Counterpart Institution
      Emory University
  • [Journal Article] Removing the parachuting artifact using two-way scanning data in high-speed atomic force microscopy2023

    • Author(s)
      Kubo Shintaroh、Umeda Kenichi、Kodera Noriyuki、Takada Shoji
    • Journal Title

      Biophysics and Physicobiology

      Volume: 20 Pages: e200006

    • DOI

      10.2142/biophysico.bppb-v20.0006

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] BioAFMviewer software for simulation atomic force microscopy of molecular structures and conformational dynamics2023

    • Author(s)
      Amyot Romain、Kodera Noriyuki、Flechsig Holger
    • Journal Title

      Journal of Structural Biology: X

      Volume: 7 Pages: 100086

    • DOI

      10.1016/j.yjsbx.2023.100086

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] PQBP5/NOL10 maintains and anchors the nucleolus under physiological and osmotic stress conditions2023

    • Author(s)
      Jin Xiaocen、Tanaka Hikari、Jin Meihua、Fujita Kyota、Homma Hidenori、Inotsume Maiko、Yong Huang、Umeda Kenichi、Kodera Noriyuki、Ando Toshio、Okazawa Hitoshi
    • Journal Title

      Nature Communications

      Volume: 14 Pages: 9

    • DOI

      10.1038/s41467-022-35602-w

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Spatiotemporal resolution in high-speed atomic force microscopy for studying biological macromolecules in action2023

    • Author(s)
      Umeda Kenichi、McArthur Steven J、Kodera Noriyuki
    • Journal Title

      Microscopy

      Volume: 72 Pages: 151~161

    • DOI

      10.1093/jmicro/dfad011

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] High-Speed Atomic Force Microscopy Reveals Spontaneous Nucleosome Sliding of H2A.Z at the Subsecond Time Scale2023

    • Author(s)
      Morioka Shin、Sato Shoko、Horikoshi Naoki、Kujirai Tomoya、Tomita Takuya、Baba Yudai、Kakuta Takahiro、Ogoshi Tomoki、Puppulin Leonardo、Sumino Ayumi、Umeda Kenichi、Kodera Noriyuki、Kurumizaka Hitoshi、Shibata Mikihiro
    • Journal Title

      Nano Letters

      Volume: 23 Pages: 1696~1704

    • DOI

      10.1021/acs.nanolett.2c04346

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Dynamics of Target DNA Binding and Cleavage by Staphylococcus aureus Cas9 as Revealed by High-Speed Atomic Force Microscopy2023

    • Author(s)
      Puppulin Leonardo、Ishikawa Junichiro、Sumino Ayumi、Marchesi Arin、Flechsig Holger、Umeda Kenichi、Kodera Noriyuki、Nishimasu Hiroshi、Shibata Mikihiro
    • Journal Title

      ACS Nano

      Volume: 17 Pages: 4629~4641

    • DOI

      10.1021/acsnano.2c10709

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Kinetochore-microtubule attachment in human cells is regulated by the interaction of a conserved motif of Ska1 with EB12023

    • Author(s)
      Radhakrishnan Renjith M.、Kizhakkeduth Safwa T.、Nair Vishnu M.、Ayyappan Shine、Lakshmi R. Bhagya、Babu Neethu、Prasannajith Anjaly、Umeda Kenichi、Vijayan Vinesh、Kodera Noriyuki、Manna Tapas K.
    • Journal Title

      Journal of Biological Chemistry

      Volume: 299 Pages: 102853~102853

    • DOI

      10.1016/j.jbc.2022.102853

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Novel DNA Aptamer for CYP24A1 Inhibition with Enhanced Antiproliferative Activity in Cancer Cells2022

    • Author(s)
      Biyani Madhu、Yasuda Kaori、Isogai Yasuhiro、Okamoto Yuki、Weilin Wei、Kodera Noriyuki、Flechsig Holger、Sakaki Toshiyuki、Nakajima Miki、Biyani Manish
    • Journal Title

      ACS Applied Materials & Interfaces

      Volume: 14 Pages: 18064~18078

    • DOI

      10.1021/acsami.1c22965

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Dynamic mechanisms of CRISPR interference by Escherichia coli CRISPR-Cas32022

    • Author(s)
      Yoshimi Kazuto、Takeshita Kohei、Kodera Noriyuki、Shibumura Satomi、Yamauchi Yuko、Omatsu Mine、Umeda Kenichi、Kunihiro Yayoi、Yamamoto Masaki、Mashimo Tomoji
    • Journal Title

      Nature Communications

      Volume: 13 Pages: 4917

    • DOI

      10.1038/s41467-022-32618-0

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Guide to studying intrinsically disordered proteins by high-speed atomic force microscopy2022

    • Author(s)
      Kodera Noriyuki、Ando Toshio
    • Journal Title

      Methods

      Volume: 207 Pages: 44~56

    • DOI

      10.1016/j.ymeth.2022.08.008

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Importance of annexin V N-terminus for 2D crystal formation and quick purification protocol of recombinant annexin V2022

    • Author(s)
      Yamada Ryusei、Trang Tran Ngoc、Flechsig Holger、Takeda Toshiki、Kodera Noriyuki、Konno Hiroki
    • Journal Title

      PLOS ONE

      Volume: 17 Pages: e0278553

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0278553

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Actin-binding domain of Rng2 sparsely bound on F-actin strongly inhibits actin movement on myosin II2022

    • Author(s)
      Hayakawa Yuuki、Takaine Masak、Ngo Kien Xuan、Imai Taiga、Yamada Masafumi D、Behjat Arash Badami、Umeda Kenichi、Hirose Keiko、Yurtsever Ayhan、Kodera Noriyuki、Tokuraku Kiyotaka、Numata Osamu、Fukuma Takeshi、Ando Toshio、Nakano Kentaro、Uyeda Taro QP
    • Journal Title

      Life Science Alliance

      Volume: 6 Pages: e202201469

    • DOI

      10.26508/lsa.202201469

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Presentation] タンパク質分子の形状と動きを直接観察できる高速原子間力顕微鏡2022

    • Author(s)
      古寺哲幸
    • Organizer
      第26回日本がん分子標的治療学会学術集会
    • Invited
  • [Presentation] Recent progress in high-speed atomic force microscopy technologies2022

    • Author(s)
      Noriyuki Kodera, Kenichi Umeda
    • Organizer
      AFM BioMed Conference
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Historical description of some of the famous model system studied in AFM, Development and current limitations in high-speed AFM2022

    • Author(s)
      Noriyuki Kodera
    • Organizer
      The Computational Biophysics of Atomic Force Microscopy
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Direct observation of the functional dynamics by which CAP1 interacts with F-actin and cofilin by high-speed AFM2022

    • Author(s)
      Phuong Doan, N. Nguyen, Hiroshi Abe, Shoichiro Ono, Noriyuki Kodera
    • Organizer
      第60回日本生物物理学会年会
  • [Presentation] 高速AFMの更なる高速化に向けたZ-スキャナの共振制御装置2022

    • Author(s)
      巽 和真, 梅田 健一, 安藤 敏夫, 古寺 哲幸
    • Organizer
      第60回日本生物物理学会年会
  • [Presentation] 高速原子間力顕微鏡のさらなる高速化を目指した超微小カンチレバーの開発2022

    • Author(s)
      片山 紀希, 梅田 健一, 安藤 敏夫, 古寺 哲幸
    • Organizer
      第60回日本生物物理学会年会
  • [Presentation] 高速AFMによる100-nmサイズの分子集団の直接観察2022

    • Author(s)
      古寺哲幸
    • Organizer
      第60回日本生物物理学会年会
  • [Presentation] High-speed AFM visualizes translational GTPase factor pool formed around the ribosomal P-stalk2022

    • Author(s)
      今井 大達, 内海 利男, 古寺 哲幸
    • Organizer
      第60回日本生物物理学会年会
  • [Remarks] 国産ゲノム編集技術CRISPR-Cas3 が二本鎖DNA を切断する仕組みを解明

    • URL

      https://www.kanazawa-u.ac.jp/rd/110105

  • [Remarks] 高速AFMが解明するタンパク質の世界

    • URL

      https://www.kanazawa-u.ac.jp/research/researcher/kokokara/research45

  • [Remarks] 古寺哲幸の研究紹介

    • URL

      https://nanolsi.kanazawa-u.ac.jp/en/research/researchers/noriyuki-kodera/

  • [Remarks] 画期的な顕微鏡法でタンパク質研究を深める

    • URL

      https://www.kanazawa-u.ac.jp/research/researcher/re-voice/rv3

  • [Patent(Industrial Property Rights)] 信号処理装置、駆動制御装置、及び、走査型プローブ顕微鏡2022

    • Inventor(s)
      古寺哲幸、巽和真、梅田健一、安藤敏夫
    • Industrial Property Rights Holder
      古寺哲幸、巽和真、梅田健一、安藤敏夫
    • Industrial Property Rights Type
      特許
    • Industrial Property Number
      特願2022-141581

URL: 

Published: 2023-12-25  

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