2021 Fiscal Year Annual Research Report
Positive and negative regulation of DNA replication by G-quadruplex/ RNA-DNA hybrids
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20H00463
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science |
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Principal Investigator |
正井 久雄 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 所長 (40229349)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | DNA複製タイミング / DNA複製開始 / クロマチンループ / 染色体高次構造 / 核膜 / 多量体形成 / グアニン４重鎖DNA / RNA-DNAハイブリッド |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究代表者は、これまでの、DNA複製の研究から、代表的な非B型核酸構造のRNA-DNAハイブリッド/グアニン４重鎖(G4)が、1)染色体高次構造形成を介した複製開始の阻害、及び、2) 複製開始の正のシグナル、のDNA複製の２種類の重要な側面に関与する可能性を発見した。1)では、進化的にヒトから酵母まで保存されたRif1タンパク質が、2)ではPriA及び機能未知の新規タンパク質が、G4を直接認識することが重要である。これまでの研究から、Rif1のG4認識に必要なドメインとその相互作用の詳細を解明し、Rif1によるクロマチン高次構造形成のモデルを提出した。またRNA-DNAハイブリッド/G4からの複製開始をin vitroで再現し、G4構造の複製開始における重要性を検証した。本研究ではこれらの発見をさらに発展させ、1) Rif1のG4結合と、多量体形成能を担うドメインの詳細な解析と、それによる核膜近傍における核内染色体高次構造に形成のメカニズム、2) RNA-DNAハイブリッド/G4に依存した普遍的な複製のメカニズム、さらに、3) 細胞内のG4を検出する新規手法の開発、G4の細胞内プロファイルの決定、そしてその多様な機能の解明を目指す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１）Rif1とG4/核膜の相互作用による複製タイミングドメイン形成メカニズム：分裂酵母Rif1の増産により、DNA複製進行が遅延し、染色体分配の異常を示し細胞死が誘導された。PP1結合変異体はDNA複製進行を遅延しないが、細胞死を誘導することから、染色体分配の異常が細胞死に関連する。Rif1増産により染色体が、核膜に集合することが観察され、Rif1の適切な発現が染色体の核内動態・構築に重要であることが示された。２）RNA-DNAハイブリッド/G4に依存する複製開始のメカニズム： G-rich配列を人為的に転写することにより、細胞内でのプラスミドとして自律的な複製を維持することができることを示した。この複製はRecA機能は依存せず、RNaseH活性により阻害される。３）RNA-DNAハイブリッド及びG4の細胞内動態の解析と新規機能の発見：（1） RNaseH1 D145Nポリペプチドプローブにより、大腸菌、酵母細胞内のゲノムワイドRNA-DNA hybrid部位を明らかにした。酵母において、detergent prewashにより、極めて明確にRNA-DNA hybridの同定が可能となり、これらは大部分tRNA, rRNA,ncRNA領域にマップされた。
（2）同様にG4プローブBG4, G4Pにより大腸菌、酵母細胞内のゲノムワイドG4部位を解析した。（3）大腸菌ゲノム上のRNA-DNA hybrid形成部位をChIP-seqにより決定した。（4） ChIPseqによりG4部位のゲノムワイド解析を行うため、G4結合DDX ヘリカーゼにtagを付加し、誘導的に発現する細胞株を樹立した。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）Rif1とG4/核膜の相互作用による複製タイミングドメイン形成メカニズム：（1）Rif1遺伝子上のリン脂質修飾(パルミトイル化)候補部位に変異を有する細胞株を樹立する。（2）Rif1のパルミトイル化責任酵素（S-アシルトランスフェラーゼZDHHC）の欠損株を樹立する。（3）これらの株において、Rif1の核膜局在、複製タイミングを検討する。２）RNA-DNAハイブリッド/G4に依存する複製開始のメカニズム：（1） 人為的な複製開始ユニットを大腸菌のゲノム上に構築し、複製能及び、細胞増殖能を維持できるか検討する。（2） RNA-DNAハイブリッドに依存する複製の生物学的意義を解析する。特に変異率に及ぼす影響を調べる。（3） 真核細胞におけるRNA-DNAハイブリッドに依存する複製が、どのような条件下、細胞周期時に作動するかを詳細に解析する。３）RNA-DNAハイブリッド及びG4の細胞内動態の解析と新規機能の発見：（1） detergent prewashの条件下で、G4 helicase (RecQ, FancJ, DHX36など)、Topoisomerase、Senatxin(rho)変異体、などにおけるRNA-DNA hybrid及びG4のゲノムプロファイル及び細胞内動態を解析する（大腸菌、酵母、動物細胞）。（2） G4リガンド-SNAPを用い、細胞内のG4を検出する新規技法を開発する（東京農工大・長澤教授との共同研究）。
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Research Products
(7 results)
