2022 Fiscal Year Annual Research Report

Identification of epistatic and breaking genes responsible for interspecific hybrid incompatibility in pepper

Research Project

Project/Area Number	20H02981
Research Institution	Kindai University
Principal Investigator	細川宗孝近畿大学, 農学部, 教授 (40301246)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	白澤健太公益財団法人かずさDNA研究所, 先端研究開発部, 主任研究員 (60527026) 安井康夫京都大学, 農学研究科, 助教 (70293917)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2024-03-31
Keywords	トウガラシ / 座止 / エピスタシス / Capsicum annuum / Capsicum chinense
Outline of Annual Research Achievements	本実験で使用できる精密な‘タカノツメ’のリファレンスをロングリード(HiFi リード)に基づき新しいリファレンスを整備した(Takanotsume HiFi)（Shirasawaら, 2022）。その情報を用いて、遺伝子の候補領域を約2.6Mの範囲に狭めることができた。B(b)遺伝子候補領域の配列を GeneScanに読み込ませ遺伝子を予測し、fasta ファイルを作成した。このfatsaをリファレンスとして用いることでRNA-seqを行った。その結果、約266kbp の中の14個の候補遺伝子に狭めることができた。同時に行っている、B(b)遺伝子候補領域のターゲットシークエンスによって、B(b)遺伝子を優性で持つ個体と劣性で持つ個体の塩基配列の違いを比較し、B(b)遺伝子の候補領域を狭めていくことにした。はじめにB(b)遺伝子を優性で持つか劣勢で持つかを特定するために種子親として C.annuum を用い、花粉親として C.chinense‘Charapita’を用いる交雑を行った。これは用いた種子親によって交雑後代が正常に発育するか座止を発現する現象を利用し、もし交雑によって得られた種子が発芽し正常個体であれば用いた C.annuum はB(b)遺伝子を劣性で持つ(aabb)と考えられ、また座止個体であれば用いた C.annuum はB(b)遺伝子を優性で持つ(aaBB)と考えられる。交雑に用いたC.annuum は‘伏見甘長’、‘昌介’、‘山科’、‘伊勢ピーマン’、‘三重みどり’、‘園研甘長’、‘石井みどり’、‘ちぐさ’、‘魁’、‘タカガミネ’の計10品種である。これらの品種のゲノム情報を用いて遺伝子の特定を行っている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 現在行っている複数品種におけるターゲットシークエンスデータが予想以上に重く、思うように解析が進んでいない。現在、かずさDNA研究所のコンピューターを用いて解析を進めているため、近いうちには結果が得られるものと考えている。その他、ターゲットにしている領域は組み換えが起こりにくい領域である可能性も高く、候補遺伝子を全てVIGSで確認したいとも考えているが、効率の良くVIGSを引き起こすことが出来る品種や方法を探索している。この実験を、できるだけ早期に終わらせ、複数のアプローチで遺伝子を特定できるように準備を進めたい。
Strategy for Future Research Activity	現在、B(b)遺伝子の候補領域をさらに狭めるために、新たに C.annuum の 10 品種についてB(b)遺伝子を優性で持つか劣性で持つかを交雑実験および発芽試験によって調査し、これらの品種についてB(b)遺伝子候補領域のターゲットシークエンスを行っている。さらに、発芽後表現型を確認したのち、交雑系統の表現型ごとに子葉のサンプリングを行い、RNA-seqを行うことで、座止個体と正常個体の遺伝子発現の違いを調査する。B(b)遺伝子を優性で持つC.annuum の‘伏見甘長’、‘昌介’、‘山科’、‘伊勢ピーマン’、‘三重みどり’の 5 品種と、B(b)遺伝子を劣性で持つC.annuum の‘園研甘長’、‘石井みどり’、‘ちぐさ’、‘魁’、‘タカガミネ’の 5 品種の計 10 品種を種子親とし、C.chinense の‘Charapita’を花粉親として用いて交雑を行い、得られた種子を播種し、発芽後、座止個体か正常個体かの表現型を確認後、各品種に分けてサンプリングしRNA-seq を行う。次に、交雑に用いている C.annuum の10品種のターゲットシーケンスを行い(現在進行中)、B(b)遺伝子を優性で持つ個体とB(b)遺伝子を劣性で持つ個体の塩基配列の違いを比較し、B(b)遺伝子候補領域を狭める。狭められたB遺伝子候補領域を VIGS により座止個体に導入し、座止症状が打破されれば、この領域がB(b)遺伝子であると特定することができる。ウイルスの接種方法の確立などの準備を行う。VIGSに用いる座止個体の植物材料として、‘タカノツメ’×‘Charapita’の交雑によって得られた種子を用いる。また予備の植物材料として‘Charapita’との交雑によって得られた座止個体の発芽率が高かった‘山科’× ‘Charapita’の種子も用いる。