2020 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation of the mechanism of DNA vaccine efficacy in fish
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20H03081
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| Research Institution | Fisheries Research and Education Agency |
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Principal Investigator |
高野 倫一 国立研究開発法人水産研究・教育機構, 水研機構(南勢), 主任研究員 (40533998)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
杣本 智軌 九州大学, 農学研究院, 准教授 (40403993)
松浦 雄太 国立研究開発法人水産研究・教育機構, 水研機構(南勢), 任期付研究員 (40823894)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | DNAワクチン / ラブドウイルス / ギンブナ / 細胞性免疫 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
魚類ラブドウイルスのGタンパク質遺伝子から作製したDNAワクチンには非常に高い感染防御効果が認められる。本研究では、ギンブナに感染するラブドウイルスのCarp Haematopoietic Necrosis Virus（CHNV）をモデルとして、魚類でDNAワクチンが有効性を発揮するためのメカニズムを解明する。
本年度は、精製したCHNVのウイルス粒子からゲノムRNAを抽出し全塩基配列を決定した。ゲノム配列中から5種類の遺伝子を予測し、本ウイルスがラブドウイルス科のVesiculovirus属のウイルスであることを明らかにした。CHNVのグリコ（G）プロテイン遺伝子またはヌクレオキャプシド(N)プロテイン遺伝子をクローン化し、遺伝子発現ベクターに挿入することでDNAワクチンを試作した。試作したDNAワクチンを導入した魚類培養細胞がGプロテインとNプロテインを一過的に産生することをウエスタンブロット解析で確認した。DNAワクチン接種によりギンブナ体内のCHNVの消長がどのように変化するかを測定するための定量PCR法を確立した。次年度以降には、DNAワクチンで免疫したギンブナ白血球が抗原を発現した細胞に対して細胞傷害活性を示すかについて解析する予定である。この解析に利用する目的で、CHNVのGタンパク質もしくはNタンパク質を恒常的に産生する培養細胞の作製に着手した。DNAワクチンの作用メカニズムを解析していくためのツールが着実に準備できている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
CHNVを感染させたギンブナヒレ由来培養（CFS）細胞からショ糖不連続密度勾配を用いて大量にウイルス粒子を精製したのち、ゲノムRNAの抽出と相補的DNA(cDNA)の合成を行った。魚類ラブドウイルスのRNAポリメラーゼ遺伝子に保存的な配列に縮重プライマーを設計し、cDNAを鋳型にしたPCRからCHNVのRNAポリメラーゼ遺伝子の部分断片を増幅し塩基配列を決定した。この配列を基にRACE法等を利用してCHNVの全ゲノム配列を取得した。CHNVゲノムにコードされた遺伝子を予測し、Gタンパク遺伝子とNタンパク遺伝子をPCRで増幅した。それぞれの増幅DNA断片をCMVプロモーターを有する遺伝子発現ベクターに別々に挿入しDNAワクチンを作製した。作製したDNAワクチンをCFS細胞にリポフェクションし、Gタンパク質とNタンパク質が一過的に産生されることをウエスタンブロットによって確認した。DNAワクチン接種魚の体内におけるウイルス消長からDNAワクチンの効果を判定をする目的で、CHNVのRNAポリメラーゼ遺伝子配列からTaqmanプローブ とPCRプライマーを設計し定量PCR法を確立した。DNAワクチンをnaiveなギンブナに筋肉注射し異常が現れないかを現在確認している。平行して、細胞傷害性試験に利用するためにGタンパク質遺伝子もしくはNタンパク質遺伝子を導入したCFS細胞を作製し、恒常的に目的タンパク質産生できるように薬剤セレクションを行なっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
CHNVのGタンパク質遺伝子またはNタンパク質遺伝子から作製したDNAワクチンをギンブナに接種し1ヶ月程度の免疫期間を設ける。免疫したギンブナにCHNVを接種し、体内でウイルスが増殖するかを定量PCRで解析することでDNAワクチンの感染防除効果を評価する。さらに、免疫した個体から種々の白血球亜集団を分画しnaiveなギンブナに移植する。移植の翌日にCHNVで攻撃し、白血球の移植により受動免疫が成立したかを調べることで、どの細胞亜集団がDNAワクチンの有効性発揮に重要であるかを解析する。また、DNAワクチンとして接種するのがGタンパク質遺伝子であった場合とNタンパク質遺伝子であった場合にはどのような差異が現れるかについても解析を進める。DNAワクチン有効性発揮のために重要な白血球亜集団が見つかった場合には、トランスクリプトーム解析を実施することでどのような免疫応答が生じているかを遺伝子発現レベルから解析する。
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