2021 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation of the mechanism of DNA vaccine efficacy in fish
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20H03081
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| Research Institution | Fisheries Research and Education Agency |
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Principal Investigator |
高野 倫一 国立研究開発法人水産研究・教育機構, 水産技術研究所(南勢), 主任研究員 (40533998)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
杣本 智軌 九州大学, 農学研究院, 准教授 (40403993)
松浦 雄太 国立研究開発法人水産研究・教育機構, 水産技術研究所(南勢), 任期付研究員 (40823894)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | DNAワクチン / ギンブナ / ラブドウイルス / 免疫 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、ギンブナに感染するラブドウイルスのCarp Haematopoietic Necrosis Virus（CHNV）をモデルとして、魚類でDNAワクチンが有効性を発揮するためのメカニズムを解明する。
令和3年度までに、CHNVの全ゲノム配列を決定した。CHNVゲノム配列から予測したグリコ（G）プロテイン遺伝子またはヌクレオキャプシド(N)プロテイン遺伝子を挿入した遺伝子発現ベクター（順に、pcDNA-CHNVgまたはpcDNA-CHNVn)をギンブナの培養細胞に導入し、目的のタンパク質が産生されることを確認した。次いで、精製したpcDNA-CHNVgまたはpcDNA-CHNVnをDNAワクチンとしてギンブナに筋肉注射し免疫した。35日間の免疫期間を設けたのち、生きたCHNVを腹腔内に注射し、ウイルスの消長と死亡率を調べた。その結果、pCDNA-CHNVgを接種した場合にCHNV感染に対する防御効果が認められた。以上の成果は日本魚病学会春季大会で発表した。
令和4年度からは、pcDNA-CHNVgで免疫したギンブナ白血球の、Gプロテイン発現細胞またはCHNV感染細胞に対する細胞傷害活性を解析する。また、免疫したギンブナの白血球をnaiveな個体に移植し、受動免疫が成立するかを確認する。次いで、白血球のトランスクリプトーム解析等を実施し、魚類のDNAワクチン有効性発揮メカニズムの解明を進める。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本課題に着手するまではCarp Haematopoietic Necrosis Virus（CHNV）のゲノム配列は決定しておらず、分類学的な位置も不明だった。本課題の実施によりCHNV全ゲノム配列が決定され、ゲノムの3’側から順にN、フォスフォ（P）、マトリックス(M)、GおよびRNAポリメラーゼ（L）プロテイン遺伝子が存在することを明らかにすることができた。分類学的にはSprivivirus属のGrass carp rhabdovirus (GCRV) と近縁であることを明らかにした。CHNVの遺伝子から作製した2つのDNAワクチン（pcDNA-CHNVgおよびpcDNA-CHNVn）を用いた試験からは、pcDNA-CHNVgにのみ感染防御効果が認められることを明らかにした。今後、これらのDNAワクチンが誘導する免疫を比較することで、魚類のDNAワクチン有効性発揮メカニズムを解析できると判断している。これらの成果はすでに学会発表した。
令和4年度からは、個体間で白血球の移植が可能なクローンギンブナを利用して、受動免疫試験や細胞傷害試験を実施する。この試験を実施するために必要な培養細胞、試験魚、および白血球マーカーに対する複数のモノクローナル抗体の準備は済んでいる。したがって、本課題はおおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和4年度からは、各々のDNAワクチンで免疫したクローンギンブナの白血球が、抗原特異的に細胞障害活性を示すか、また、免疫個体の白血球を移入することで受動免疫が成立するか、を評価する。
細胞傷害活性試験については、pcDNA-CHNVgまたはpcDNA-CHNVnで免疫したギンブナから白血球亜集団(IgM陽性、IgM陰性、CD8陽性など）をMagnetic-activated cell sorting (MACS)を用いて分離し、CHNVを感染させたギンブナ培養細胞とin vitroで共培養し細胞傷害活性を測定する。細胞傷害活性の測定には乳酸脱水素酵素（LDH）活性を指標に用いる。
受動免疫については、あらかじめ各DNAワクチンで十分に免疫したギンブナ（ドナー）から末梢血、腎臓および脾臓を採取し、同様にMACSを利用して白血球亜集団を分画する。DNAワクチンで免疫したギンブナとsyngenicな系統のnaiveギンブナ（レシピエント）に、分画した白血球亜集団を移入し、CHNV感染に対する抵抗性が増大するかを実験感染の死亡率やウイルス消長から評価する。
CHNVの感染防除に関わる白血球亜集団が見つかった場合には、最終年度（令和５年度）終了までにトランスクリプトーム解析を実施し、DNAワクチン有効性発揮に関わる分子やカスケードを明らかにする。
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