2021 Fiscal Year Annual Research Report
脊椎動物の染色体凝縮を担うコンデンシンの構造基盤と動的挙動の解明
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20H03197
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| Research Institution | University of Shizuoka |
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Principal Investigator |
原 幸大 静岡県立大学, 薬学部, 准教授 (80729343)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
橋本 博 静岡県立大学, 薬学部, 教授 (40336590)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | X線結晶構造解析 / 染色体凝縮 / コンデンシン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、脊椎動物の染色体凝縮を担うコンデンシンのnon-SMCサブユニットの結晶構造を高分解能で決定すると共に、ヌクレオソームやSMCサブユニットとの複合体を再構成し、SAXS、Cryo-EMにより動的挙動を解析することを目標とする。また、染色体の再構成系を用いた構造機能相関解析を通して、菌類のモデルでは説明できない脊椎動物特有の染色体凝縮の作用機序を原子レベルで明らかにすることにある。染色体凝縮の機能不全はがんや小頭症を引き起こすことから、その分子メカニズムを理解することで抗がん剤創薬が期待できる。
本年度は、コンデンシンIIのnon-SMCサブユニットの一つであるCAP-G2-H2、コンデンシンIのnon-SMCサブユニットであるCAP-G-H、及びDNAとの複合体の結晶化条件の探索を重点的に行っており、微結晶が得られているが構造解析に適した結晶は得られていない。今後、結晶構造解析に加えて、Cryo-EM測定と単粒子解析のための準備を進める。また、コンデンシンI・IIの他のnon-SMCサブユニットであるCAP-D3-H2に関してはヒトホモログに加えて複数の脊椎動物ホモログを用いて組換えタンパク質発現系の構築を進めている。CAP-D2-Hに関しては、組換えタンパク質の精製純度を改良するために、HisタグからGSTタグにアフィニティータグを変更した組換えタンパク質発現系の構築を中心に進めた。コンデンシンホロコンプレックスやヌクレオソームとの複合体の再構成系の構築も進めたいが、non-SMCサブユニットの調製と構造解析が当初計画よりもやや遅れているため、今後はnon-SMCサブユニットの構造解析にさらに重点を置く。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
昨年度までに、CAP-D3-H2を除く全てのコンデンシンI・IIのnon-SMCサブユニットの調製方法を確立したものの、結晶構造解析に成功したのはCAP-G-Hのみであるため。今後、Cryo-EMによる構造解析も視野に入れて研究を進める。
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| Strategy for Future Research Activity |
コンデンシンIIのnon-SMCサブユニットであるCAP-G2-H2の構造解析、及びCAP-D3-H2の試料調製に重点を置く。
コンデンシンIのnon-SMCサブユニットであるCAP-D2-Hの組換えタンパク質の純度を向上させるために、HisタグからGSTタグにアフィニティータグを変更した発現系を再構築した。グルタチオンセファロース樹脂を利用した精製を組み込むことで組換えタンパク質の純度の向上を目指す。もう一つのnon-SMCサブユニットであるCAP-G-Hについては、引き続き２本鎖DNAとの複合体の結晶化条件の探索を行う。
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