2020 Fiscal Year Annual Research Report
Structural basis and reaction mechanism of [FeFe] hydrogenases
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20H03215
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
緒方 英明 北海道大学, 低温科学研究所, 特任准教授 (30795935)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 酵素 / 水素 / 赤外分光 / 電気化学 / 酵素反応 / ヒドロゲナーゼ / 生物無機化学 / 構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒドロゲナーゼは多くの微生物が持つ金属酵素で、水素分子の分解や合成を可逆的に触媒する。本研究では、2つのタイプの[FeFe]ヒドロゲナーゼの反応機構の解明を目指す。電子伝達分岐型[FeFe]ヒドロゲナーゼは、2つの異なる酸化還元電位をもつ電子伝達体（フェレドキシンとNADH）から電子を受け取り、活性中心であるHクラスターで水素を合成する。この特異な電子伝達に関してどのようにして活性中心へ伝達されるのか（活性中心やフラビン・[FeS]クラスターの酸化還元状態）を、分光学的手法や構造解析により明らかにする。また、水素センサーと考えられている調節型[FeFe]ヒドロゲナーゼの活性中心の酸化還元状態を分光学的手法により明らかにする。本年度は、[FeFe]ヒドロゲナーゼ遺伝子（電子伝達分岐型HydABCと調節型HydS）を、それぞれベクターに導入し大腸菌による発現系を構築しモデル化合物を挿入することによって人工的に成熟化した。これらの[FeFe]ヒドロゲナーゼのさまざまな酸化還元状態を電気化学的FTIR分光法で解析した。さらに、電子伝達分岐型[FeFe]ヒドロゲナーゼの電子顕微鏡による構造解析をマックスプランク研究所と共同で行った。また、調節型[FeFe]ヒドロゲナーゼの活性中心近傍のプロトン輸送経路と予想されるアミノ酸に対して変異体を導入し水素酸化活性を測定し、 ある変異体で水素酸化活性がほとんど消失していることを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
[FeFe]ヒドロゲナーゼ遺伝子（電子伝達分岐型HydABCと調節型HydS）を、それぞれベクターに導入し大腸菌による発現系を構築しモデル化合物を挿入することによって人工的に成熟化した。これらの[FeFe]ヒドロゲナーゼのさまざまな酸化還元状態を電気化学的FTIR分光法で解析した。活性中心近傍のプロトン輸送経路と予想されるアミノ酸に対して変異体を導入し水素酸化活性を測定し、 ある変異体で水素酸化活性がほとんど消失していることを明らかにした。また、電子伝達分岐型[FeFe]ヒドロゲナーゼの電子顕微鏡による構造解析をマックスプランク研究所と共同で行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
電子伝達分岐型[FeFe]ヒドロゲナーゼを高純度に精製し結晶化・X線結晶構造解析を行うと同時に電子顕微鏡法による構造解析も引き続き試みる。調節型ヒドロゲナーゼはPASドメインが異なるタイプのヒドロゲナーゼの発現系を構築し、その分光学的特徴をFT-IR法などを用いて調べる。さらに分光学的手法を用いて活性中心の電子状態変化を測定し、また、さらなる変異体導入などによりプロトン伝達経路を明らかにする。これらを総合して反応機構の解明に取り組む。
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