2021 Fiscal Year Annual Research Report
光受容体タンパク質が形成する超分子構造とシグナル伝達の分子動態機構の解明
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20H03223
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
山下 隼人 大阪大学, 基礎工学研究科, 助教 (10595440)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
林 文夫 神戸大学, 理学研究科, 名誉教授 (80093524)
森垣 憲一 神戸大学, バイオシグナル総合研究センター, 准教授 (10358179)
粟津 暁紀 広島大学, 統合生命科学研究科(理), 准教授 (00448234)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 光受容体 / ロドプシン / GPCR / オリゴマー / シグナル伝達 / 高速原子間力顕微鏡 / バイオイメージング / 1分子動態 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、光受容体ロドプシン(Rh)の光照射に伴う1分子レベルでの構造変化やRhとシグナル伝達分子であるG蛋白質トランスデューシン(Gt)との相互作用動態を高速原子間力顕微鏡(高速AFM)で捉えることを目指しており、昨年度、そのためのAFM赤外光てこ光学系や暗室AFM装置環境の構築を行い、また比較的規模の大きな2量体列構造を持つRhの試料調製も行った。そこで本年度はこれらを用いて、まず光照射に伴うロドプシン(Rh)の構造変化の観察を試みた。暗所において2量体から成る列構造を形成するRhを高速AFMで観察すると2つの輝点が列状に並んでいる様子が観察されるが、その観察中に外部から緑色光を照射したところ、輝点の見え方に変化が生じた。Rhは暗状態、明状態(活性化状態)のそれぞれの結晶構造がすでに明らかにされており、それらによると暗状態から明状態への構造変化に伴ってRhの細胞質側(C末端側)表面のループ構造が2量体内で近づくことが分かっている。そこでこれらの結晶構造をもとに高速AFM像の再構成を行った結果、Rh2量体の２つの輝点が近づくことが示された。このことから、高速AFMで観察された輝点の変化は光照射に伴うRhの構造変化に由来するものであると考えられる。
次にRhとGtの相互作用の高速AFM観察を行うために、暗所でGtを機械的に投与するためのAFMシステムの構築を行った。Gtをマイクロ流路へ通して微量精密ポンプでAFM観察チャンバーへと転送する機構を作製し、完全暗所でGtを安定かつ迅速に投与できるようになった。また、Gtとの相互作用を観察するには、高活性な機能を保持したRh超分子クラスターの構築も必要になるため、パターン化膜技術のAFM計測への応用も試みた。専用の治具を作製することでAFM観察に用いる極微小ガラスステージの表面にポリマー膜からなるパターンを形成することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
高速AFMによる光受容体ロドプシン(Rh)超分子クラスターの高分解能観察により、本研究で達成を目指す課題の一つであるRhの暗状態からの光照射に伴う構造変化の一端を本年度捉えることに成功した。また、RhとGtの相互作用の高速AFM観察のための、薬剤を機械的(半自動的)に投与するAFMシステムの構築を行い、完全暗所でGtを安定かつ迅速に投与できるようになった。更には、高活性なRh超分子クラスターを実現するための高速AFM計測用パターン化膜の構築も進められた。これらの成果により、今後、高速AFMによるRhとGtとの相互作用の1分子レベルでの高分解能観察に繋がると期待できる。また、結晶構造を用いてRhとGtの相互作用部位における構造揺らぎの数理解析も行い、揺らぎの方向と2量体列構造との相関の検討も進められた。
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| Strategy for Future Research Activity |
ここまでに得られた成果をもとに、光照射に伴うロドプシン(Rh)の構造変化の更なる高分解能観察による解析を行うとともに、暗所下で高速AFM観察中にトランスデューシン(Gt)を投与することで、RhとGtとの相互作用の観察を行う。更に観察中に光を照射することで、相互作用の動態の変化を解析する。また、その後、GTPの投与も行い、Gtの挙動の変化も観察する。それぞれの過程におけるAFMデータの定量・統計解析を通して、超分子クラスター上でのGtの動態を明らかにする。パターン化膜にRhを導入した高速AFM用サンプルの計測も試みることで、前述の計測の高効率化や再現性も高めていく。これらと並行して、RhとGtの相互作用における構造揺らぎの数理解析も進め、そこへ高速AFMで得られたデータや知見も反映することで、光受容体タンパク質Rhが形成する2量体列構造のシグナル伝達における機能・構造的役割を明らかにする。
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Research Products
(37 results)
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[Journal Article] Ribosomal protein L5 facilitates rDNA-bundled condensate and nucleolar assembly2022
Author(s)
Matsumori Haruka、Watanabe Kenji、Tachiwana Hiroaki、Fujita Tomoko、Ito Yuma、Tokunaga Makio、Sakata-Sogawa Kumiko、Osakada Hiroko、Haraguchi Tokuko、Awazu Akinori、Ochiai Hiroshi、Sakata Yuka、Ochiai Koji、Toki Tsutomu、Ito Etsuro、Goldberg Ilya G、Tokunaga Kazuaki、Nakao Mitsuyoshi、Saitoh Noriko
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Journal Title
Life Science Alliance
Volume: 5
Pages: 1-18
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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