2021 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation of the mechanisms underlying the execution of necroptosis
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20H03475
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| Research Institution | Toho University |
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Principal Investigator |
中野 裕康 東邦大学, 医学部, 教授 (70276476)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
寺井 健太 京都大学, 医学研究科, 准教授 (20616073)
柳川 正隆 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 研究員 (70609792)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ネクロプトーシス / FRET / イメージング / DAMPs / トランスジェニックマウス / シスプラチン / 1分子イメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1) 野生型マウスにシスプラチンを投与すると血清BUNやCreatinineが上昇し、それに伴いリン酸化RIPK3陽性細胞と活性化型カスパーゼ3陽性細胞が出現し、投与２日後にピークとなった。そこで樹立したSMART トランスジェニック(Tg)マウスにシスプラチンを投与し、48時間後に多光子顕微鏡を用いてFRET解析を行った。シスプラチン投与によりまず近位尿細管の閉塞が誘導され、さらにその後で一部の尿細管上皮細胞でFRET/CFP比が上昇することが明らかとなった。ネクロプトーシスの実行遺伝子であるRipk3を欠損させたSMART Tgマウスにシスプラチンを投与したところ、SMART Tg;Ripk3-/- マウスでは尿細管上皮の傷害はおこるものの、尿細管の閉塞はみられずFRET/CFP比の上昇も見られなかった。
2) MLKLの細胞膜上の動態の 1分子イメージングとミトコンドリアの細胞外への放出を同時にイメージングするために、MLKL-HaloTag発現細胞に、ミトコンドリアターゲッテイングシグナル配列を付加したMito-mCherryを同時に発現させ、ミトコンドリアを可視化できる細胞を樹立した。予備実験としてMito-mCherryを発現する細胞にネクロプトーシスを誘導すると、細胞膜障害に伴いmCherryのシグナルが細胞外へと放出されることを確認した。今後この細胞を用いてMLKLの1分子イメージングとMito-mCherryの細胞外放出についてのイメージングを同時に行う予定である。
3)ネクロプトーシスに伴い放出されるDAMPsをin vitroおよびin vivoで可視化するために、HMGB1-mCherryトランスジェニックマウスを樹立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1)COVID-19の拡大のために昨年度は、マウスを京都大学の松田研究室に移動させることができず、実験が中断していた。本年度は、シスプラチン腎障害モデルを用いてin vivoのイメージングに成功しており、順調に実験を行うことができた。現在論文を投稿予定である。
2) ネクロプトーシス細胞のMLKLの1分子イメージングについては、やや遅れていたが、1分子イメージングにより見られるMLKLの凝集体と細胞内容物であるDAMPsの放出の同時イメージングをするためのツールを作成することができたことから、今後研究が順調に進捗すると考えられる。
3)ネクロプトーシスに伴い放出されるDAMPsをin vitroおよびin vivoで可視化するために、HMGB1-mCherryトランスジェニックマウスを樹立した。このマウスの腹腔マクロファージを採取して、HMGB1-mCherryのネクロプトーシスやパイロトーシスに伴う放出のイメージングを今後行う予定であり、この点については予想以上の進捗が得られた。
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| Strategy for Future Research Activity |
1) DAMPsの１種類であるHMGB1-mCherryをin vitroおよびin vivoで可視化することのできるHMGB1-mCherry Tgマウスが樹立することができた。このマウス由来のマクロファージを用いてネクロプトーシスやパイロトーシス時に放出されるIL-1betaやHMGB1-mCherryの放出のkineticsなどをLCI-S（live cell imaging for secretion）を用いて詳細な解析を行う予定であり、今後予想以上に研究は進捗すると考えられる。
2)さらにin vivoにおけるネクロプトーシスのFRET解析と同時にHMGB1の細胞外への放出をイメージングするために、SMART; HMGB1-mCherry Tgマウスを樹立する予定である。
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[Presentation] Interleukin-11-expressing fibroblasts control a feed-forward loop in the tumor microenvironment.2021
Author(s)
Takashi Nishina, Deguchi Yutaka, Wakami Takeda, Satoshi Ueha, Yuko Kojima, Mizuho Nakayama, Masanobu Oshima, Hideo Yagita, Tetuo Mikami, Kouji Matsushima, Hiyoyasu Nakano
Organizer
The 80th Annual Meeting of the Japanese Cancer Association
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