Development of novel transmission blocking vaccine targeting microgamete surface antigen of Plasmodium falciparum

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20H03480
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 鳥居 本美 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 特命教授 (20164072)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 橘 真由美 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 助教 (00301325) ; 石野 智子 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (40402680) ; カレトン リチャード 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 教授 (10503782) ; 入子 英幸 神戸大学, 保健学研究科, 准教授 (60346674)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 熱帯熱マラリア / ワクチン / 伝搬阻止 / 雄性生殖体 / 単クローン抗体

Outline of Annual Research Achievements

申請者らのネズミマラリア原虫を用いた先行研究において高い伝搬阻害活性が示されたミクロガメート表面タンパク質(MiGS)の熱帯熱マラリア原虫における相同体(PfMiGS)を標的とする単クローン抗体の作成を行なった。PfMiGSのシグナルペプチドとC末の膜貫通領域を除くほぼ全長の領域を、小麦胚芽由来無細胞タンパク質合成法を用いてGST融合タンパク質（rPfMiGS-full）として合成した。rPfMiGS-fullを抗原として３匹のBALB/cマウスを４回免疫した後に、ELISA法により各マウス血清中の抗体価を測定したが、ELISA法による抗体価の上昇は３匹共に弱く、IFAにおいてもミクロガメート表面への反応が認識されなかった。２回の追加免疫を行った後に実施したELISA法およびWestern-blot法においても、免疫抗原のタグに用いたGSTに対する抗体価の上昇しか認められないことが判明した。そこで、より高い免疫応答を得るために、ネズミマラリアの系で高い伝搬阻止活性を示した際の主要な抗原部位であったRegion 6に着目し、PfMiGSにおける相同領域（PfMiGS-R6）に対する組換えタンパク質（rPfMiGS-R6）を作成した。rPfMiGS-R6を用いて３匹のBALB/cマウスを計５回免疫した後に、血清を採取してELISA法による抗体価の測定を行ったところ、３匹のマウス共に抗体価の上昇が認められた。IFAにおいてもmicrogameteへの反応が確認されたので、抗体価の最も高いマウス１匹を用いてハイブリドーマを作製した。培養上清を用いたELISA法により３次の単クローン抗体を産生する細胞のスクリーニングを実施した結果、最終的に免疫抗原に比較的強く反応する単クローン抗体を産生する１個の細胞株（3F4）を得ることが出来た。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究を進める上で中心となる単クローン抗体作成において、当初計画していた組換え子タンパク質（rPfMiGS-full）を用いたマウスの免疫において、追加免疫を行っても免疫抗原に対する抗体価の上昇が認められなかった。そこで、抗体の反応部位が限られるものの、抗体価の上昇が見込まれる領域（Region 6）に絞って免疫抗原となる組換えタンパク質（rPfMiGS-R6）を作成して、再度マウスの免疫を実施したところ、抗体価の上昇が認められたので、ハイブリドーマ作成へと進んだ。ハイブリドーマの培養上清を用いたELISAの結果をもとに、３次のスクリーニングを行なって単クローン抗体を産生する株を樹立したが、単クローン抗体のサブクラスが今後の研究を進めるには扱い難いIgMであった。以上の状況から、年度中にPfMiGSに対する複数の単クローン抗体を作成し、それを用いてPfMiGSの性状解析に進むという当初の計画に対してやや遅れている状況にあると判断した。

Strategy for Future Research Activity

本研究で重要な役割を果たす単クローン抗体の作成を継続する。その為に、既にrPfMiGS-R6を用いて５回の免疫を行って抗体価の上昇が認められた２匹のマウスに更に２回の追加免疫を行う。ELISA法により血清中の抗体価の上昇が確認されたマウスを用いてハイブリドーマの作成を行う。免疫に用いたrPfMiGS-R6を抗原とするELISAによるスクリーニングを行なって、目的とする単クローン抗体を産生するハイブリドーマの樹立をめざす。並行して、単クローン抗体の抗原特異性の検定を容易にする為に、PfMiGSにMycタグを付加した遺伝子組換え原虫およびPfMiGS遺伝子を欠損する組換え原虫を作成する。作成した単クローン抗体と組換え原虫を用いて、単クローン抗体の反応特異性の検定を行い、また、未だ解析が進んでいないPfMiGSの生殖母体から生殖体期原虫における発現様式など詳細な性状解析を行う。