エレノアの液滴形成による転写活性化と乳がん再発における役割解明

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20H03520
• Research Institution: Japanese Foundation for Cancer Research
• Principal Investigator: 斉藤 典子 公益財団法人がん研究会, がん研究所 がん生物部, 部長 (40398235)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: ノンコーディングRNA / 液滴 / 液-液相分離 / 乳がん / エストロゲン受容体

Outline of Annual Research Achievements

細胞核内には生体膜に囲まれない凝集体が数多く存在し、これらの多くは液-液相分離によって形成される液滴であると示唆されている。液相分離は、溶液の相転移現象の1つで、均一な溶液が濃度や温度などの変化によって相溶性が変化して、一相から二相状態になることをいう。液相分離で形成される液滴は、特定の立体構造をもたないタンパク質とRNAがアフィニティーは低いが多点で相互作用し、高い密度と流動性を付与するなど、今までに知られている分子間相互作用のみでは説明不可能な「状態変化」を表すものである。
乳がんの70%はエストロゲン受容体（ER）を発現するER陽性型で、エストロゲンを枯渇する内分泌療法が効果的である。しかし、長期治療後に高い頻度で再発することが問題である。再発ER陽性乳がん細胞においては、タンパク質をコードしない長鎖ノンコーディングRNAエレノアが高発現し、核内でエレノアクラウドと称する構造体を形成して、がんの増殖に関わる遺伝子群を活性化する。エレノアクラウドは、エレノアRNAとそれに相互作用するタンパク質が液-液相分離という物理現象をおこした結果の「液滴構造」であると示唆されるが詳細は不明で、本研究で解明に取り組む。エレノアクラウドの液滴としての特徴と機能を解析し、既知の分子相互作用だけでは説明がつかない、「液滴形成を介した効率的な転写活性化」の分子メカニズムを乳がんで明らかにすることを目的とする。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

（1）エレノアクラウドの形成と機能の解明
本研究では既に、ヒトER陽性乳がん細胞株MCF7を長期にわたってエストロゲン枯渇下で培養し、エストロゲン非依存性に増殖する、すなわち内分泌療法抵抗性獲得再発乳がんを再現するMCF7-LTED細胞を樹立している。しかしMCF7の核型の複雑性が今後のSeq解析の解釈を困難にするため、より正常な核型をもつER陽性乳がん細胞由来のHCC1642細胞を用いて同様にLTED細胞を樹立した。これらを用いてRNAのゲノム相互作用をグローバルに解析するために、ChIRP (chromatin isolation by RNA purification) -SeqとRADICLE (RNA And DNA Interacting Complexes Ligated and sequenced)-Seq解析を試みた。ChIRP解析においては、コントロール実験として、無関係な配列（LacZ）を標的にしたプローブを使った。また、細胞をRNase処理した実験をコントロール実験として設定して、RNAを介した相互作用であることを検証した。これらの結果、ChIRPとRADICLE 実験で安定して再現性のある結果を得た。現在、統計解析などの高次解析を行っている。
(2)エレノアに特異的に結合するタンパク質因子の同定
ChIRP-MS（質量分析）解析の準備を行った。プローブとしたエレノア2を特異的にプルダウンできるビオチン化オリゴDNA、プルダウンの際の条件、ネガティブコントロールの設定など、最適化を行った。

Strategy for Future Research Activity

今までの研究をさらに発展させる。別プロジェクトの結果から、エレノアが30%の乳がん、40%のER陽性乳がん患者検体で検出されること、原発乳がんでも検出されるがそれらの多くのケースは閉経後（エストロゲン枯渇）であることなど、細胞株での結果と相関することがわかってきた。また、原発乳がんでのエレノアクラウドの形成が、術後5年以上たって再発する晩期再発を予測するマーカーであることなどがわかってきた。これらを踏まえて、エレノアのゲノム結合部位や相互作用タンパク質の解析はますます重要と考え、本研究を推進してゆく。また昨年度より引き続き、乳がん細胞移植マウスに関して、樹立と解析を進める。マウス個体内で生育した腫瘍について、ヘマトキシリン-エオシン染色、免疫染色、FISH解析を行い、がんの形態やERを含むマーカータンパク質の発現、さらにエレノアクラウドの形成を確認する。その後、液滴形成を阻害する1, 6 ヘキサンジオールを投与して腫瘍形成への影響を調べる。

Research Products

• [Int'l Joint Research] ViQi Inc(米国)
  • Country Name: U.S.A.
  • Counterpart Institution: ViQi Inc
• [Journal Article] The ELEANOR non-coding RNA expression contributes to cancer dormancy and predicts late recurrence of ER-positive breast cancer (2022)
  • Author(s): Fukuoka, M., Ichikawa, Y., Osako, T., Fujita, T., Baba, S., Takeuchi, K., Tsunoda, N., Ebata, T., Ueno, T., Ohno, S., *Saitoh, N.
  • Journal Title: Cancer Science Volume: 113, 2336-235 Pages: -
  • DOI: 10.1111/cas.15373
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Ribosomal protein L5 facilitates rDNA-bundled condensate and nucleolar assembly (2022)
  • Author(s): Matsumori, H., Watanabe, K., Tachiwana, H., Fujita, T., Ito Y., Tokunaga, M., Kumiko Sakata-Sogawa, K., Osakada, H., Haraguchi, T., Awazu, A., Ochiai, H., Sakata, S., Ochiai, K., Toki, T., Ito, Et., Goldberg I., Tokunaga, K., *Nakao, M., *Saitoh, N.
  • Journal Title: Life Science Alliance Volume: 5 (7) Pages: e202101045
  • DOI: 10.26508/lsa.202101045
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Modeling population size independent tissue epigenomes by ChIL-seq with single thin sections. (2021)
  • Author(s): Maehara, K., Tomimatsu, K., Harada, A., Tanaka, K., Sato, S., Fukuoka, M., Okada, S., Handa, T., Kurumizaka, H., Saitoh, N., Kimura, H., *Ohkawa, Y.
  • Journal Title: Mol Syst Biol. Volume: 17(11) Pages: e10323
  • DOI: 10.15252/msb.202110323
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Importin α2 association with chromatin: Direct DNA binding via a novel DNA-binding domain (2021)
  • Author(s): Jibiki, K., Kodama, T., Suenaga, A., Kawase, Y., Shibazaki, N., Nomoto, S., Nagasawa, S., Nagashima, M., Shimodan, S., Kikuchi, R., Okayasu, M., Takashita, R., Mehmood, R., Saitoh, N., Yoneda, Y., Akagi, K., *Yasuhara, N.
  • Journal Title: Genes to Cells, Volume: 26 (12) Pages: 945-966
  • DOI: 10.1111/gtc.12896.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Chromatin structure-dependent histone incorporation revealed by a genome-wide deposition assay. (2021)
  • Author(s): Tachiwana, H., Dacher, M., Maehara, K., Harada, A., Seto, Y., Katayama, R., Ohkawa, Y., Kimura, H., Kurumizaka, H., *Saitoh, N.
  • Journal Title: eLife Volume: 10 Pages: e66290
  • DOI: 10.7554/eLife.66290
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Nuclear long non-coding RNAs as epigenetic regulators in cancer. (2021)
  • Author(s): Tachiwana, H., *Saitoh, N.
  • Journal Title: Current Medicinal Chemistry Volume: - Pages: -
  • DOI: 10.2174/0929867328666210215114506.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Non-coding RNAs regulate the 3D genome architecture in breast cancer. (2022)
  • Author(s): Saitoh, N.
  • Organizer: 6th International Anatomical Sciences and Cell Biology Conference;
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] ノンコーディングRNAによる乳がんのエピジェネティクス制御. (2022)
  • Author(s): 斉藤典子
  • Organizer: エピジェネティック療法研究会第14回講演会
  • Invited
• [Presentation] 乳がんにおけるエピジェネティクス：再発乳がんに関わるノンコーディングRNAエレノアの解析. (2022)
  • Author(s): 斉藤典子
  • Organizer: Breast Cancer Expert Seminar
  • Invited
• [Presentation] 乳がんにおけるエピジェネティクス：再発乳がんに関わるノンコーディングRNAエレノアの解析. (2022)
  • Author(s): 斉藤典子
  • Organizer: Future Generations Breast-Cancer Oncologist & Pathologist Conference
  • Invited
• [Presentation] RPL5 maintains spatial organization of the ribosomal DNA arrays through regulation of biophysical properties of the nucleolus (2021)
  • Author(s): Saitoh, N., Matsumori, H., Watanabe, K., Tachiwana, H., Ito, Y., Sakata-Sogawa, K., Tokunaga, M., Awatsu, A., Nakao, M.
  • Organizer: 第44回日本分子生物学会年会
  • Invited
• [Presentation] ELEANOR non-coding RNAs associate with chromatin and regulate the 3D genome structure in breast cancer. (2021)
  • Author(s): Saitoh, N.
  • Organizer: The 30th Hot Spring Harbor International Symposium, Chromatin Potential in Development and Differentiation,The 6th Symposium of the Inter-University Research Network for Trans-Omics Medicine;
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] ELEANOR ncRNAs regulate the 3D genome structure in recurrent breast cancer. (2021)
  • Author(s): Yamamoto, T., Ichikawa, Y., Fukuoka, M., Saitoh, N.
  • Organizer: Keystone Symosia on Molecular and Cellular Biology. Non-coding RNAs: Biology and Applications;
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] ELEANOR-chromatin interaction facilitates ESR1 transcription：非コードRNAエレノアとクロマチンの相互作用を介したESR1遺伝子の転写活性化. (2021)
  • Author(s): 市川雄一, 斉藤典子
  • Organizer: 第80回日本癌学会学術総会
• [Presentation] ER陽性乳がん細胞で発現する長鎖非コードRNA ELEANOR2はRNAクラウドを形成し転写を促進する. (2021)
  • Author(s): 市川雄一
  • Organizer: 第44回日本分子生物学会年会
• [Presentation] 再発乳がんの脆弱性に関わるゲノム３次元構造と核内ノンコーディングRNA. (2021)
  • Author(s): 斉藤典子
  • Organizer: 日本生化学会関東支部オンライン例会
  • Invited
• [Presentation] ノンコーディングRNA による核内構造とゲノム制御. (2021)
  • Author(s): 斉藤典子
  • Organizer: 2021年日本バイオインフォマティクス学会年会・第10回生命医薬情報学連合大会(IIBMP2021)
  • Invited
• [Presentation] 乳がんのノンコーディング RNA による 3 次元ゲノム構造制御. (2021)
  • Author(s): 斉藤典子, 山本達郎, 市川雄一, 福岡恵
  • Organizer: 日本遺伝学会第93回大会
  • Invited
• [Presentation] The non-coding RNA world in cancer：広がるノンコーディングRNAの世界. (2021)
  • Author(s): 斉藤典子
  • Organizer: 第80回日本癌学会学術総会
  • Invited
• [Presentation] 乳がんの再発に関わるノンコーディングRNAとクロマチン構造. (2021)
  • Author(s): 斉藤典子
  • Organizer: 第8回がんエピゲノムシンポジウム＆第3回造血器腫瘍研究セミナー合同シンポジウム
  • Invited
• [Presentation] ELEANOR non-coding RNA correlates with late recurrence in ER positive breast cancer, partly through CD44 gene activation：エレノアノンコーディングRNAは、CD44遺伝子の活性化を一部に介して、ER陽性乳癌の晩期再発に関与する. (2021)
  • Author(s): 福岡恵, 市川雄一, 角田伸行, 上野貴之, 斉藤典子
  • Organizer: 第80回日本癌学会学術総会
• [Presentation] Analysis of chromatin dynamics using permeabilized cells and reconstituted histone complex：透過性細胞とヒストン複合体を用いたクロマチンダイナミクスの解析. (2021)
  • Author(s): 立和名博昭, 胡桃坂仁志, 斉藤典子
  • Organizer: 第80回日本癌学会学術総会
• [Presentation] Analysis of histone dynamics in cancer cells：がん細胞におけるヒストンダイナミクスの解析. (2021)
  • Author(s): 立和名博昭
  • Organizer: 第80回日本癌学会学術総会
  • Invited
• [Presentation] クロマチン構造による遺伝子発現制御機構：ヒストンH2A.Zによる転写活性化クロマチン認識機構の解析. (2021)
  • Author(s): 立和名博昭, 大川恭行, 胡桃坂仁志, 斉藤典子
  • Organizer: 第94回日本生化学会大会
  • Invited
• [Presentation] ヒストンバリアントの形成するクロマチン構造と機能の解析. (2021)
  • Author(s): 立和名博昭
  • Organizer: 第94回日本生化学会大会
  • Invited
• [Book] 「病理と臨床」2022年臨時増刊号40巻 (2022)
  • Author(s): 立和名博昭、斉藤典子
  • Total Pages: -
  • Publisher: 文光堂
  • ISBN: 978-4-7581-0404-3
• [Book] Cytogenomics (2021)
  • Author(s): Ichikawa Y., *Saitoh, N.
  • Total Pages: Chapter 18, 357-372
  • Publisher: Elsevier Inc.
  • ISBN: 9780128235799
• [Book] 「生化学」 (2021)
  • Author(s): 山本達郎, 市川雄一, 斉藤典子生化学
  • Total Pages: 93 (1)
  • Publisher: 公益財団法人 日本生化学会
• [Book] 「遺伝学の百科事典 継承と多様性の源」 (2021)
  • Author(s): 渡辺健司、斉藤典子
  • Total Pages: 第10章エピジェネティク
  • Publisher: 丸善出版/日本遺伝学会
  • ISBN: 978-4-621-30660-4
• [Remarks] がん研究所がん生物部
  • URL: http://202.242.5.28/laboratory/department/cancer_biology/www/index.html
• [Remarks] がん研究所
  • URL: https://www.jfcr.or.jp/laboratory/department/cancer_biology/index.html