2022 Fiscal Year Annual Research Report
再生分化による網膜の機能再現と網膜変性疾患の新規治療
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20H03845
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| Research Institution | National Rehabilitation Center for Persons with Disabilities |
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Principal Investigator |
世古 裕子 国立障害者リハビリテーションセンター(研究所), 研究所 感覚機能系障害研究部, 研究部長 (60301157)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
東 範行 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 非常勤講師 (10159395)
金田 誠 日本医科大学, 大学院医学研究科, 大学院教授 (30214480)
富田 浩史 岩手大学, 理工学部, 教授 (40302088)
梅澤 明弘 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, 研究所, 研究所長/再生医療センター長/バイオバンク長 (70213486)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 網膜 / ダイレクト・リプログラミング / 視細胞様細胞 / ミューラー細胞 / 網膜視細胞モデル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
網膜は一度損傷を受けると回復しない。本研究は、視覚障害の原因となる網膜変性疾患の病態解明や創薬に応用するため、低コスト・簡便で汎用性が高い細胞培養システムを確立するための基盤的研究である。これまでに、視細胞の発生に関わる４種類の転写因子を用いたダイレクト・リプログラミングで、ヒト皮膚線維芽細胞から約１週間で光刺激に応答する視細胞様細胞を分化誘導できること、この方法で作製した網膜色素変性患者細胞由来の変性視細胞モデルが病態解析の一助になる可能性を示した。令和３年度には、スモールスケール（24-well plateの使用）のアッセイ系で、ヒト皮膚線維芽細胞由来変性視細胞モデルの半定量評価を行い、光トランスダクション関連遺伝子などが変性視細胞モデルにおいて発現低下していること、ERストレス阻害剤（4-PBA）によって発現がノーマライズされることを明らかにし、薬剤スクリーニングへの応用の可能性を示した（令和４年度に国際誌に掲載、業績欄参照）。令和４年度には、誘導レベルの不完全性と不均一性の改善に向けた実験にもエフォートを割いた。網膜分化関連転写因子が異なる順で結合された３種類のポリシストロニックベクター（視細胞ポリベクター）を用い、網膜発生過程の再現に関する検証、分化レベルの検証を継続した。同時に、ダイレクト・リプログラミングの適応拡大、すなわち低コスト・鋭敏な評価系を目指し、これまでの24-well プレートから、あらたに96-wellを用いた分化誘導とアッセイを試み、これまでと同様の結果が得られるかどうかを調べ、上記実験に用いた。
また、患者細胞モデルの実験も継続し、EYSと光トランスダクション、細胞死との関連等を調べ、網膜変性機序の全容解明に向けて解析を継続した。さらに、ゼブラフィッシュモデルの解析結果も統合することを目指し、ノックアウトの繁殖を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
新型コロナウィルス感染拡大の影響によって物品の納入が遅れるなどの状況があり、令和２年度から令和３年度には、やや進捗の遅れがあった。しかし、令和４年度には大きなトラブルもなく、おおむね順調に進んだ。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、誘導レベルの不完全性と不均一性の改善と変性視細胞モデルの解析を継続し、ダイレクト・リプログラミングの適応拡大に繋げる。さらにミューラー細胞を用いた研究成果の論文化を目指すとともに、動物モデルを用いた検証も行い、これまでの成果を総括する。
網膜前駆細胞の作製では、網膜前駆細胞を誘導する３種類の転写因子遺伝子を挿入したポリシストロニックベクター（前駆細胞ポリベクター）を用い、ヒト皮膚線維芽細胞株に導入し、培養条件の改善を繰り返し、各種網膜細胞への分化誘導を目指し、ポリシストロニックベクター（視細胞ポリベクター）の導入による網膜視細胞の作製と解析では、４種類の網膜分化関連転写因子が異なる順で結合された３種類のポリシストロニックベクター（視細胞ポリベクター）を用いた分化誘導を継続し、発現解析や機能解析によって分化レベルの比較を行い、論文化を目指す。
ミューラー細胞からの誘導実験では、令和４年度には進捗が見られたため、今後は論文化を目指し、追加解析を行う。
動物モデルを用いた検証では、当研究室で樹立された変異の種類が異なる複数のゼブラフィッシュモデルを用いた発現解析および機能解析を行い、上記細胞モデルを用いた実験結果と統合する。
2020年-2023年の研究成果を総括する。
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