2022 Fiscal Year Annual Research Report
Biological Significance of DNA-PK in the Orchestration of Cellular Response to DNA Double-strand Breaks
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20H04334
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
松本 義久 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 教授 (20302672)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
横谷 明徳 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 量子生命科学研究所, 専門業務員 (10354987)
島田 幹男 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 助教 (20548557)
泉 雄大 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 量子生命科学研究所, 主任研究員 (20595772)
松尾 光一 広島大学, 放射光科学研究センター, 准教授 (40403620)
林 宣宏 東京工業大学, 生命理工学院, 教授 (80267955)
石合 正道 国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 施設長 (90298844)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | DNA依存性プロテインキナーゼ(DNA-PK) / 放射線 / DNA修復 / タンパク質リン酸化 / タンパク質間相互作用 / タンパク質構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、DNA二重鎖切断(DSB)のセンサーであるDNA依存性プロテインキナーゼ(DNA-PK) が何をしているのか、何のために存在するのかを明らかにすることを目的としている。(1)DNA-PKによるXRCC4のリン酸化の意義の解明を進めるため、リン酸化部位を含む領域を欠失する変異体を作製した。GFPプルダウンと質量分析により、全長XRCC4及びこの欠失変異体に結合する分子を同定した。DNA-PKcs、Ku86、Ku70、LIG4など、XRCC4とともに非相同末端結合(NHEJ)に関わるタンパク質群は全長と欠失変異体の両者でほぼ等量検出された。一方、全長に比べて欠失変異体で著しく少ないタンパク質が数種類見つかった。その結果から、DNA-PKによるXRCC4のリン酸化がDNA損傷応答経路のクロストークに関わる可能性が示唆された。(2)正常XRCC4及びリン酸化部位変異体の二量体及び多量体について 円二色性スペクトル測定及びX線小角散乱測定を行った。その結果、リン酸化はβストランド量を増加させ、フィラメント状の会合体形成の調整に関わることが示唆された。(3)XRCC4の結合分子の一つであるAPTXの解析を行った。ゲノム編集によってAPTXの欠損細胞を作製し、放射線・薬剤感受性、DSB修復能などを解析した。また、GFP-APTX発現細胞で、レーザー照射部位への集積を指標としてDNA損傷部位への動員を解析した。さらに、GFPレポーター基質とI-SceIを用いたNHEJ機能解析を行った。その結果を総合して、APTXがXRCC4とは異なる機構でDNA二重鎖切断修復に関与することを明らかにした。(4)二次元電気泳動とAI解析を組み合わせた新たなプロテオミクス的手法により、放射線照射に応答して現れるスポットを数十個見出した。DNA-PKの新規基質探索の新しいアプローチとして期待される。
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| Research Progress Status |
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
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