2020 Fiscal Year Annual Research Report
Tissue-engineered skeletal muscle for myokine secretion
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20H04520
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| Research Institution | Osaka Institute of Technology |
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Principal Investigator |
藤里 俊哉 大阪工業大学, 工学部, 教授 (60270732)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中村 友浩 大阪工業大学, 工学部, 教授 (30217872)
横山 奨 大阪工業大学, 工学部, 講師 (30760425)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 組織工学 / 培養骨格筋 / マイオカイン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、骨格筋の運動に伴って分泌されるマイオカインが注目されている。これまでに組織工学・再生医療技術を用い、長さ約15mm・直径約0.5mmと小さいながらも、電気刺激によって収縮運動可能な三次元培養骨格筋を作製し、さらに、培養骨格筋駆動部が交換でき、繰り返し屈伸運動できるデバイスを開発してきた。本研究はこの研究開発成果を活用することで、マイオカインを分泌させる培養骨格筋デバイスを開発し、最終的に動物に投与することでその効果を確認することまでを企図している。そのため、次の4つの課題を逐次的に検討している。すなわち、初年度（令和2年度）にマイオカインを分泌させるための培養骨格筋デバイスを作製し(課題1)、次年度（令和3年度）以降にデバイスを用いた細胞影響評価を行う(課題2)。そして最終年度（令和4年度）までに、マイオカイン同定ならびに至適分泌条件を確立するとともに(課題3)、開発したデバイスにてマイオカインを大量分泌させ、動物に投与してその効果を実際に観察・確認できるまで展開する(課題4)。
初年度である令和2年度は、課題1について、1日以上の持久的な収縮運動を可能にする電気刺激条件の策定、および、新たな機械刺激によるデバイスの開発を行った。これまでの電気刺激では、pHの変化に伴う培地の変成や、1時間以上の刺激では疲労による収縮力の低下といった問題が生じていた。種々の条件にて検討した結果、5V, 0.5Hz, 2msecの条件下で連続して21日間まで電気刺激が可能で、収縮力を増大させることが可能であった。また、新たな機械刺激デバイスでは、6ウェル細胞培養プレート内で培養骨格筋の一端を、Arduinoで駆動制御するステッピングモーターにて駆動するリニアステージに設けた腕部に固定し、他端をXYステージで固定する構造のデバイスを作製した。2日間連続した刺激を与えた結果、収縮力が増大することを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和2年度は課題1について、電気刺激ならびに機械刺激による収縮力の影響を検討した。電気刺激では5V, 0.5Hz, 2msecの条件下で、(A) 7日間電気刺激培養、(B) 7日間通常培養を行い，その後7日間電気刺激培養、(C) 14日間通常培養を行い，その後7日間電気刺激培養、(D) 7日間電気刺激培養を行い，その後14日間通常培養、(E) 14日間電気刺激培養、(F) 21日間電気刺激培養、の6群について検討した。その結果、controlと比較したところ、A群には違いが見られなかったが、B，C，D群では周囲の筋管組織の厚みが増大していた。収縮力はA，B，C群では収縮力が増加し、分化初期の方が影響の大きいことが示唆された。しかし，D，E，F群群では収縮力に変化は見られなかったことから、14日以上の長期的な刺激は負荷が大きい可能性が示唆された。
機械刺激では、伸縮距離3.6㎜，伸縮速度18mm/s，伸縮周波数0.56Hzの条件下で2日間連続刺激した。その結果、2日間連続駆動しても培養骨格筋の破断などは認められず、また、刺激しなかったものと比較して筋管層が厚くなっており、収縮力も増加した。
これらの成果を複数の学会で発表し、論文投稿も準備中である。以上のことから、令和2年度の達成度は順調であると自己評価する。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和2年度は課題1に対し、電気刺激条件を検討・調整することで、長期間の連続刺激を可能にした。また、等張性収縮(厳密には完全な等張性ではないが)を与える機械刺激デバイスを作製した。同時に、マイオカインであるIL-6の測定方法の検討を開始した。
令和3年度は課題2に対し、両方のデバイスについてさらなる条件の改良を加え、IL-6産生量を測定することで、IL-6を指標としたマイオカイン産生の至適条件を探索する。また、機械刺激しつつ他の細胞と長期間共培養できるデバイスを作製する。さらに、正常マウス・ラットなどから単離した初代筋芽細胞からの培養骨格筋作製も予定する。
これらによって、種々のモードの収縮運動を網羅的に、連続的あるいは間欠的に所定期間、最大7日間程度与え、ターゲット細胞と共培養することで効果を評価する。ターゲット細胞には各種がん細胞、神経細胞や血管内皮細胞、その他を予定している。なお、生体筋は神経末端から分泌されたアセチルコリンにて筋活動電位が生じ、筋小胞体からカルシウムイオンが放出されて筋収縮する。培養骨格筋では電気刺激にて細胞膜が脱分極し、筋小胞体からカルシウムイオンが放出されて筋収縮するため、神経支配すなわち能動的運動に近いと考えられる。一方、機械刺激ではその過程がないため、リハビリでマッサージする受動的運動に近いと考えられる。そこで特に以下を明確化できる条件設定を計画している。
・等張性運動と等尺性運動の違い ・運動強度、持続時間による違い ・休息の効果
・電気刺激による能動的運動と機械刺激による受動的運動の違い
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Research Products
(7 results)
