2022 Fiscal Year Annual Research Report
氷晶径を制御した新規凍結乾燥技術および凍結乾燥細胞の生存率向上
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20K04310
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
上松 天 大阪大学, 大学院工学研究科, 招へい研究員 (10867774)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
西橋 勉 大阪大学, 大学院工学研究科, 招へい研究員 (00517469) [Withdrawn]
木村 正 大阪大学, 大学院医学系研究科, 教授 (90240845)
瀧内 剛 大阪大学, 大学院医学系研究科, 特任准教授(常勤) (40733358)
佐治 史惠 大阪大学, 医学部附属病院, 技術職員 (40600987)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 凍結乾燥 / 氷晶径 / 細胞 / 精子 / 凍結乾燥保存 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、液滴を真空中に導入して蒸発熱により瞬時に凍結させ、その後昇華させるという微噴凍結乾燥技術を基盤とし、氷晶制御による凍結乾燥細胞の生存率向上を目的とした。検証細胞としてヒト精子およびマウス精子を用いた。ヒト精子の運動能を維持した凍結乾燥は未だ例がなく、実現できれば不妊治療における精子保存の簡便化、低コスト化に繋がる。
令和2年度は、まず最適な噴霧条件を調査し、噴霧後の精子損傷を抑えつつ真空中へ安定噴霧できる条件を決定した。そして精子を含む凍結乾燥粉体の作製に成功したが、精子は凍結段階で運動能を全て失うことも判明した。凍結粒子をラマン分光法で評価したところ、氷はアモルファスではなく結晶化していることが判明し、氷晶による精子損傷が示唆された。
令和3年度は、噴霧・凍結による精子損傷原因を調査した。孔径50, 100, 200μmのノズルで、まず噴霧後の精子を評価した。孔径50μmのみ、運動率の有意な低下および先体の崩壊が見られた。精子の長さは60μm程度のため、孔径50μmではノズルと接触し精子が損傷すると考えられた。また3種のノズルで凍結させた精子は全て運動能を消失し、細胞膜が損傷していた。従来の液体窒素浸漬凍結法ではこのような結果は見られないため、真空中への噴霧または比較的高い冷却到達温度(-20～-40℃)で生じた氷晶による精子損傷が示唆された。
令和4年度は、大気中で液体窒素へ液滴を噴霧して凍結させた。しかし凍結後の精子は全て運動能を失い、細胞膜が損傷していた。よって真空中への噴霧や冷却到達温度が原因ではないと判明した。精子損傷の原因は、精子に最適な冷却速度を達成していないことと考えられる。
本研究では、目標である精子の運動能を維持した凍結乾燥は未達成となったが、精子の損傷原因を詳細に調査したことで、凍結乾燥細胞の生存率向上に向けた今後の研究発展に貢献する内容である。
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