Development of a novel fermentation process using N2-fixing Escherichia coli

2022 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20K05800
• Research Institution: Osaka Research Institute of Industrial Science and Technology
• Principal Investigator: 駒 大輔 地方独立行政法人大阪産業技術研究所, 森之宮センター, 主任研究員 (80443547)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 古屋 俊樹 東京理科大学, 理工学部応用生物科学科, 准教授 (20367064)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 窒素固定 / ニトロゲナーゼ / 大腸菌 / アセチレンアッセイ / 人工オペロン / Klevsiella

Outline of Annual Research Achievements

Klevsiella oxytoca由来の人工合成した遺伝子をPCRを用いてつなぎ合わせ、nifUS、nifENB、nifFMY、nifJVW、nifHDKの5つの人工オペロンを作製した。それらを、Red相同組換え法を用いて、大腸菌の染色体の各位置に挿入した。次に、P1ファージを用いて、各大腸菌株をP1ライセート化し、P1トランスダクションにより、K12株に順次遺伝子を移した。菌株はカナマイシンを含むLB寒天培地で選抜した。また、選抜したコロニーから、FLP/FRT部位特異的組換え法により、カナマイシン遺伝子を除去した。これにより、再度、P1トランスダクションで、カナマイシン耐性で菌株が選抜できるようになった。これらの一連の操作（P1トランスダクションとFLP/FRT部位相同的組換え法）を繰り返すことで、染色体の5か所の位置に各人工オペロンを挿入することができた。PCRを用いて、14種類の遺伝子が染色体上に挿入されていることを確認した。人工オペロンの各遺伝子の発現をT7プロモーターで制御しているため、T7RNAポリメラーゼ遺伝子（lacプロモーター制御）を染色体DNAに導入した。この遺伝子も正しく挿入されていることをPCRで確認した。
次に、リアルタイムPCRを用いて、各遺伝子が発現（転写）されているかどうかの確認を行った。比較のために、大腸菌MG1655株を用いた。遺伝子発現誘導剤であるIPTGのある場合とない場合とを試験した。その結果、MG1655株では遺伝子の発現が見られなかったが、人工オペロンを導入した株では各遺伝子の発現が見られた。不思議なことに、IPTGを添加していない条件でも、遺伝子の発現が見られた。
最後に、これらの菌株のニトロゲナーゼ活性の確認（アセチレンアッセイ）と、窒素固定による生育試験を行った。しかしながら、両試験で想定された結果は得られなかった。