2020 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of sulfur-assimilation mechanism in bifidobacteria
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20K05801
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| Research Institution | Setsunan University |
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Principal Investigator |
和田 大 摂南大学, 農学部, 教授 (00301416)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
吹谷 智 北海道大学, 農学研究院, 講師 (10370157)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ビフィズス菌 / 硫黄代謝 / システイン / メチオニン / シスタチオニン / 逆流硫黄経路 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究代表者らは，ビフィズス菌のシステイン (Cys) / メチオニン (Met) 代謝の全容解明を目指して研究を進めてきた．ビフィズス菌は広くCys要求性であると考えられてきたが，これまでの研究から，Bifidobacterium longum subsp. longum 105-A（105-A株）をはじめとする複数の菌株のCys要求性は，Metで代替可能であることを明らかにしている．これらの菌株はMetからCysへ代謝する逆流硫黄経路を有することが推定される．本経路は，(I) Metからホモシステイン(Hcy) へ代謝するS-Adenosyl methionine回路，(II) Hcyからシスタチオニン (Cth)，さらにCysへと代謝する経路により構成されると考えられる．(II) の経路の解明を目的として，CthからCysへと代謝するCystathionine-γ-lyase (CGL), HcyからCthへと代謝するCystathionine-β-synthase (CBS) の機能を有する酵素遺伝子について，105-A株のゲノム配列からの同定を進めBL105A_0509とBL105A_0510をCGL，CBSをコードする遺伝子と予測した．本年度は，それらの機能について，遺伝子欠損株を用いた解析を行った．
BMM+Cys培地ではどちらの欠損株も野生株と同様の生育が観察されたが，BMM+Met培地では両変異株ともに生育の低下が観察された．さらに，BMM+Cth培地ではΔBL105A_0509は野生株と同様に生育したが，ΔBL105A_0510は生育の低下が観察された．これらの結果から，BL105A_0509とBL105A_0510はそれぞれCBS, CGLの機能を持つ遺伝子であると考えられた．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究計画で予定していた推定ホモシステイン合成酵素遺伝子BL105A_0756のクローニングと大腸菌での発現に成功している。本遺伝子産物の発現はSDS-PAGEで確認し，良好なタンパク質の生産が確認された。本遺伝子産物の無機イオウ取り込みへの関与はまだ確かめられていないが、Cystathionine-γ-lyase (CGL), Cystathionine-β-synthase (CBS)の候補遺伝子について，二重相同組み換え法を用いた遺伝子欠損株の構築にも成功しており，全体としての進捗は順調であるといえる．さらにΔBL105A_0509，ΔBL105A_0510株を用いて，ビフィズス菌最少培地 (BMM) に単一有機硫黄源としてCys / Met / Cthを添加した培地を用いた生育試験を行い，野生株とΔBL105A_0509，ΔBL105A_0510の間で生育を比較する実験も実施しておりCGL，CBSの同定に関しては予定以上に進捗している。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究ではヒト由来ビフィズス菌、Bifidobacterium longum 105-A株（以下105-A株）の硫黄取り込み酵素をコードする遺伝子の同定を行い含硫アミノ酸代謝の全容を解明する。
1) 推定ホモシステイン合成酵素(AHS)遺伝子の大腸内での発現と性質解明。推定ホモシステイン合成酵素遺伝子BL105A_0756のクローニングと大腸菌での発現に成功しているので，本遺伝子産物が実際にホモセリンからホモシステインを合成する無機イオウ取り込み活性を持っているのかを検証する。
2) 遺伝子破壊による検証。研究分担者の吹谷らが開発した標的特異的遺伝子破壊法によって、BL105A_0756を破壊する。硫化物イオン(S2-)を単一硫黄源とした培地で105-A株と0756破壊株（Δ0756株）を培養して、生育に差がみられるかを観察する。Δ0756株が生育できない、あるいは生育が低下していれば、0756が実際に硫黄同化酵素として機能している証明となる。またΔ0756株でも硫化物イオンを単一硫黄源として生育可能であれば、0756以外にも硫黄同化反応を担う酵素が存在することになる。
３）BL105-A_0756以外のAHS遺伝子の探索と機能の解明。上記1)，2)の方法で0756だけが硫黄同化を担っていることが明らかであれば、それ以上の検討は必要ない。その場合は申請者らにより存在が確認されているものの、遺伝子は同定されていな いシスタチオニンβシンターゼ、シスタチオニンγリアーゼの同定を継続して行い、ビフィズス菌の硫黄代謝の全容を解明する。しかし、他にも硫黄同化酵素が存在すると考えられる場合は、他のAHS遺伝子の探索を行う。
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| Causes of Carryover |
研究計画で予定していた推定ホモシステイン合成酵素遺伝子BL105A_0756のクローニングと大腸菌での発現に成功した。本遺伝子産物の発現はSDS-PAGEで確認し，良好なタンパク質の生産が確認された。しかし、本遺伝子産物の無機イオウ取り込みへの関与は，活性測定法の確立に手間取り，まだ確かめられていない。次年度において、活性測定法を確立する予定でする。また、その際に基質、生成物として必要になるシスタチオニンは、比較的高価な試薬であり、次年度使用額はその購入し使用する。
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