2022 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of sulfur-assimilation mechanism in bifidobacteria
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20K05801
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| Research Institution | Setsunan University |
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Principal Investigator |
和田 大 摂南大学, 農学部, 教授 (00301416)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
吹谷 智 北海道大学, 農学研究院, 教授 (10370157)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | ビフィズス菌 / 硫黄代謝 / 含硫アミノ酸 / システイン / メチオニン / シスタチオニン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ビフィズス菌のアミノ酸代謝，特に含硫アミノ酸（システイン (Cys) /メチオニン (Met) ）代謝の知見は不十分である．我々は，ビフィズス菌のCys /Met代謝の全容解明を目指しておりBifidobacterium lomgum subsp. longum 105-A（105-A株）のCys要求性はMetで代替可能であり，MetからCysへ代謝する逆流硫黄経路を有することを示した．現在，Cys/Met代謝に関与する酵素遺伝子の同定を進めている．遺伝子破壊実験により逆流硫黄経路後半のcystathionine-beta-synthase (CBS), cystathionine-gamma-lyase (CGL)をコードする遺伝子の同定を試みた結果，BL105A_0509 (0509)がCBSをBL105A_0510 (0510)がCGLをコードする遺伝子であると考えられた．
本研究では0509，0510を大腸菌で発現させて，組換えタンパク質の機能解析を行った。組換えタンパク質はpETシステムを用いてEscherichia coli BL21 Rosetta 2 (DE3)株を用いて生産し、His-trapカラムで精製した。組換え0509はO-アセチルセリンとホモシステインからシスタチオニンを生成する活性を示したが，セリンは基質としなかった。したがって, 0509遺伝子産物は細菌によく見られるO-acetylserine dependent CBS (EC 2.5.1.134)であることが明らかになった。この結果は，ビフィズス菌のシスタチオニン代謝酵素の活性を初めて直接に示したものである。一方，同様に調製した組換え0510は有意なcystathionine lyase活性を示さなかった。この原因については現在，解析中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初はビフィズス菌の含硫アミノ酸代謝の全容を解明するため，ビフィズス菌において無機イオウを含硫アミノ酸に取り込む酵素の同定を目指していた。BL105A_0756 (0756)がO-acetyl-L-homoserine sulfhydrylaseをコードする遺伝子であると考え,活性の検出を試みたが，検討の範囲では活性が検出されなかった。そこで，含硫アミノ酸代謝において重要な中間体であるシスタチオニンの代謝酵素にも注目してさらに組換えタンパク質の機能解析を進めることとした。そのため，新たな活性測定の条件検討などに時間を要した。全体の研究の進捗はやや遅れているが，本来の目的である「ビフィズス菌の含硫アミノ酸代謝の全容解明」にはむしろ得られる知見の幅が広がり，ポジティブであると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在までにアミノ酸配列の解析によってBL105A_0509, BL105A_0510, BL105A_0756, BL105A_1451の４つの遺伝子産物がシスタチオニン代謝酵素をコードしていると考えられた。これらの４つの酵素を大腸菌中で発現させるためプラスミドは４つとも構築済みである。2022年度の研究でBL105A_0509遺伝子産物がO-acetylserine dependent CBS (EC 2.5.1.134)であることが明らかになったので，今後は残りの３つの遺伝子産物の機能解析を行う。さらにBL105A_0510やBL105A_0756の機能に関しても，考えられる反応について検出を試みる。
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| Causes of Carryover |
現在までにアミノ酸配列の解析によってBL105A_0509, BL105A_0510, BL105A_0756, BL105A_1451の４つの遺伝子産物がシスタチオニン代謝酵素をコードしていると考えられた。これらの４つの酵素を大腸菌中で発現させるためプラスミドは構築済みである。2022年度の研究でBL105A_0509遺伝子産物がO-acetylserine dependent CBS (EC 2.5.1.134)であることが明らかになったので，今後は残りの３つの遺伝子産物の機能解析を行う。また，タンパク質の生成は確認できたものの有意なcystathionine-lyase活性を示さなかったBL105A_0510に関しても，生産されたタンパク質が正しいものであるのかの検証も含めて検討を行う。
そのため，次年度（2023年度）には酵素反応生成物を同定するためHPLCなどを行う予定であり，消耗品費としてHPLCカラムや酵素反応用の基質が必要となる。
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