2020 Fiscal Year Research-status Report
Creation of novel amino acid metabolizing enzymes by genome information and protein engineering
| Project/Area Number |
20K05816
|
|---|
| Research Institution | Osaka Institute of Technology |
|---|
Principal Investigator |
大島 敏久 大阪工業大学, 工学部, 教授 (10093345)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
|
| Keywords | 耐熱性酵素 / 人工酵素 / アミノ酸脱水素酵素 / アミノ酸脱炭酸酵素 / タンパク質工学 / 酵素分析 / 酵素リアクター |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、これまで報告例がない新規NADP依存性L-アルギニン脱水素酵素（L-ArgDH）の大腸菌を宿主とする遺伝子組換えによる生産、精製、酵素化学的性質の解明を行った。常温菌Pseudomonas veloniiの推定L-ArgDHをコードする遺伝子を大腸菌で高発現させることに成功した。リン酸カリ緩衝液系（20 mM, pH 7.2,0.01％ 2-メルカプトエタノール添加）で懸濁した大腸菌細胞の超音波破砕液中に高いNADP依存性L-ArgDHが検出できた。しかし、酵素は不安定のため安定化を行った。その結果、10％グリセロールの添加により酵素が安定化することが判明した。その安定化条件で、ニッケルアフィニティクロマトグラフィーによって酵素を均一に精製することに成功した。精製酵素の酵素化学的特徴を解析した結果、この酵素は分子質量65 kDa の2量体構造をとる。またNADPが良好な補酵素活性を示し、電子供与体としてはL-Argに特異的で、他のD-ArgやL-Lys含む多くのL-アミノ酸には触媒活性を示さなかった。この酵素のL-Argの脱アミノ反応の最適pH は 9.5、最適温度は30℃に認められた。また、10％グリセロール添加した場合、低温で少なくとも1か月間安定に保存可能であった。この酵素の応用として、Ｌ-Argの分光学的定量法を検討した。その結果、Ｌ-Argの 5-100μMの濃度範囲で438 nｍの吸光度との間に直線関係が得られ、簡便で特異的な微量分析法の開発に成功した。これらの成果は、現在学術誌に投稿準備中である。また、高度耐熱性インジゴ還元酵素の機能と構造解析や脱水素酵素の機能解析やバイオ電池への応用に関する成果を発表した。好熱菌L-TrpDHの推定遺伝子を見出し、その合成遺伝子の大腸菌での発現と機能、構造解析を今後行う予定である。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
常温菌Pseudomonas菌由来のL-ArgDHの遺伝子の大腸菌における発現に成功したが、その安定化条件を見出す実験に、予定より長時間を要したことが、遅れたことの最大の原因である。また、好熱菌でのゲノム情報での検索から、L-ArgDHに高い配列相同性をもつ酵素遺伝子を見出すことができず、さらにL-ArgDHの遺伝子への変異導入による耐熱性酵素の簡便な創製法の設定に時間を要したことも遅れの原因である。さらに、新型コロナウイルス禍による研究成果のとりまとめと実験的データの収集にあてる時間の減少も遅れの一因といえる。
|
| Strategy for Future Research Activity |
常温菌のL-ArgDHに関しては、これまでの成果を学術誌投稿すべく、原稿をできるだけ早く作成し、公表する予定である。他大学の研究協力者による構造解析が現在進行中であるので、その解析が終了したら、立体構造情報から、耐熱化、安定化のデザインを行い、変異を導入により、耐熱性酵素を創製する。また、酵素の構造と機能情報をもとに基質や補酵素特異性の変換、高活性化などをタンパク質工学的に図る予定である。
一方、ゲノム情報からL-ArgDHとアミノ酸の配列の相同性が40-50％の酵素遺伝子を好熱菌に見出しているので、その酵素の大腸菌での発現と精製、機能と構造解析を進め、変異導入などにより、安定性を向上したL-ArgDHの創製を試みる。L-TrpDHに関しては、好熱菌に遺伝子ホモログを見出し、その合成遺伝子を大腸菌で発現し、活性の同定を進める予定である。次に、メソジアミノピメリン酸脱炭酸酵素から変異導入により人工の耐熱性D-アミノ酸脱炭酸酵素の創製を進める。FMN-依存性インジゴ還元酵素やNAD依存性のリジン脱水素酵素への変異導入により、機能改変した人工酵素の創製についても同様に検討を進める予定である。
|
| Causes of Carryover |
当初予定していた常温菌由来のL-ArgDHの大腸菌での遺伝子組換えには成功したが、酵素が予想以上に不安定であったために、その安定化条件の探索に時間を要した。また、機能解析実験にも時間を要した。さらに、当初予定していた結晶構造解析の実験が遅れたことと、その情報に基ずいた耐熱性酵素の創製のための、タンパク質工学的な変異導入のデザインとその変異酵素の作成実験までに至らなかった。それゆえ、それらの実験などを行う上で必要な薬品や器具類などの消耗品の購入に至らなかった。また、研究協力者との研究の打ち合わせや得られた成果の学会発表を行う予定であったが新型コロナウイルス禍のために、できなくなったことによる旅費の使用額の減少につながった。令和３年度は、令和２年度に於いて進まなかった実験を精力的に推進し、二研究機関の協力者との研究打ち合わせを行うための出張も予定している。また研究成果発表のための論文投稿も令和２年度と令和３年度分について予定している。さらに学会や研究会での講演発表なども積極的に行っていく予定であるので、令和３年度分として請求した助成金と合わせた使用計画をたてている。
|
