2020 Fiscal Year Research-status Report
The molecular and functional generality of the Basidiomycetous siderophore that promotes mycelial growth and fruiting body formation
| Project/Area Number |
20K05866
|
|---|
| Research Institution | University of Shizuoka |
|---|
Principal Investigator |
恒松 雄太 静岡県立大学, 薬学部, 講師 (30629697)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
早川 一郎 日本大学, 文理学部, 教授 (20375413)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
|
| Keywords | 担子菌 / 生合成 / コプリノフェリン / 子実体 / シデロフォア / 天然物 / 生理活性分子 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
担子菌ウシグソヒトヨタケ(Coprinopsis cinerea)遺伝子改変株から発見した鉄結合性分子コプリノフェリン(CPF)は、同菌の生活環において菌糸成長・子実体（いわゆる、キノコ）形成活性を有す生理活性分子である。遺伝子相同性検索の結果、Coprinopsis属だけでなく数多くの担子菌ゲノム中にCPF類似の生合成遺伝子クラスター(BGC)が含まれていることが示唆された。それに反して、これまでの天然物化学・物質探索研究の長い歴史において、他の担子菌種からCPF分子が見いだされた報告は一例もなかった。そこで私は、担子菌類においてCPF分子が微量ながら普遍的に存在し、それら菌体のなかでヒトヨタケ同様の生理的役割(菌糸成長・子実体形成活性)を担っているのでないかと仮説立て、本研究で検証することとした。加えて、上記の生理活性を利用し、培養が困難、あるいは栽培化が難しいといった担子菌キノコ種(例えばマツタケなど)について、CPF分子、あるいは人為的に機能向上させたCPF関連人工合成分子を巧みに操ることで、上記のような担子菌種の栽培化を可能にすることが期待できる。私のオリジナル分子「CPF」の研究は、長年の謎「キノコ（子実体）がなぜ生えるのか」といった基礎的な研究にアプローチするためのツールとなるだけに留まらず、産業応用化も狙える点で意義があると考え、本研究に取り組んでいる。
マイタケ・アミガサタケなど食用担子菌キノコ種の公開ゲノム情報から、これらの菌にはCPFを生合成する遺伝子が含まれることが示唆された。本年度においては、これら食用担子菌キノコ種にCPF分子が含有されるかを分析調査するための基盤整備を行った。一方で、ヒトヨタケ近縁種に確かにCPFが含有される点が明らかになったため、次年度以降は系統的に多様な担子菌種におけるCPF存在の確認を行う予定である。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
まず市販の食用キノコ種(子実体部分)にCPFが含有されるかどうかを調査した。約10種の食用キノコ子実体部を凍結乾燥後、有機溶媒にて抽出しLC-MSにて分析した結果、いくつかのキノコ種でCPFが検出された。特にゲノム中にCPFの類似BGCをもつキノコ種にて選択的にCPFが検出され、仮説が正しいものと思われた。しかし、現状本実験に再現性が得られておらず(処理中のCPFの分解の可能性やLC-MS汚染状況による検出閾値変化などが理由として想定された)、絶対的定量を行う必要があると考えた。そこで、CPF分子のアセチル基を重水素化体で置換したD3-CPFを合成し、これをCPF定量における内部標準として用いた分析法を樹立した。このD3-CPFを加えた溶媒にてキノコ抽出・前処理を行いLC-MS定量を行った。しかし、測定したD3-CPF量は理論値の10%ほどであった。これは試料処理中におけるD3-CPFの分解に起因する(つまりCPFも分解している)と考察しており、その改善について現在方法を検討中である。
一方でC. cinereaと系統的に近いCoprinus属担子菌を対象とした検討を行った。既に入手していた7種の担子菌について、ゲノム解読を行った。ゲノムDNAおよびRNA-seqのデータからアセンブリおよびアノテーションを行い、AntiSMASH解析に供したところ5種の担子菌においてCPF類似型BGCを見出した。これらの菌株を液体培養し、代謝産物解析したところ1種の担子菌にて再現良くCPFが検出された。以上の結果から、Coprinus属担子菌にて遺伝子レベルでCPF生合成系が保存されているが、化合物レベルではCPFの産生度合いに差が認められることが判明した。但し前述の通り、未だ分析系が不十分な点も問題として残されており、次年度にて改善の必要がある。
|
| Strategy for Future Research Activity |
1. 前述した通り、CPF分析系の改善を行う。担子菌種によっては抽出過程にてCPF分子の分解が起こっている可能性がある。合成したD3-CPFを用い、分解を防ぐ抽出・分析条件を確立する。現在までに市販の食用キノコ種の子実体からはCPF検出の再現性が得られていない。CPF分子の生理機能から推察するに、担子菌生活環のうち子実体期よりも菌糸体期の方でCPF生産が促進されている可能性が高いと再考した。よって、NITE等のカルチャーコレクションから食用キノコ種を購入し、液体培養を行うことでCPF検出を行うことも検討する。
2. Coprinus属とは異なる属の担子菌種において、CPFが検出され得るかを検証し、担子菌におけるCPF分子の普遍性を明らかにする。
3. 難培養性、栽培困難な担子菌種に対してCPF分子をケミカルツールとして培養の効率化を目指す。
4. 独自にデザインしたCPF誘導体分子の合成により、担子菌におけるCPF機能に摂動を引き起こす。CPF機能の向上などにより、産業的に使用され得るケミカルツールを開発する。
|
| Causes of Carryover |
1. 新型コロナウイルスの影響で教職員・学生の学内入校が制限された期間があり、少なからず本研究の円滑な進行が阻害された。
2. CPF分析系が未だ確立できておらず、本研究の一つの鍵としていた「NITE由来担子菌培養物ライブラリ124種」が実施できる状況になかった。消耗品費として50万円ほどを本研究項目に計上していたため、これは次年度以降、分析系確立に目処がつき次第、計画通りに執行する予定である。
3. 研究分担者早川一郎は、2020年4月に日本大学文理学部に教授として着任した。学内ルールの制限のために着任一年目は学生配属に恵まれず、今年度早川教授以外に実際に手を動かす人材を準備することができなかった。そのため共同研究部分にも少々の遅れが生じているが、次年度で計画研究を十分に実施すべく、次年度使用分に経費を流用することと再計画した。
|
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
[Presentation] Diels-Alderase CghA の全容解明2020
Author(s)
岸本真治, 佐藤道大, Jamieson Cooper, 横山葵, 成田一仁, 前田直哉, 恒松雄太, 原幸大, 橋本博, Houk Kendall N., 渡辺賢二
Organizer
日本農芸化学会2020年度大会
-
[Presentation] 酵素的Diels-Alder反応におけるジアステレオ選択性の制御機構2020
Author(s)
佐藤道大, 岸本真治, Jamieson Cooper, 成田一仁, 前田直哉, 原幸大, 橋本博, 恒松雄太, Houk N. Kendall, Yi Tang, 渡辺賢二
Organizer
日本薬学会第140年会(京都)
-
-
