2022 Fiscal Year Annual Research Report
体細胞クローン胚への改変処理に基づく遺伝子ノックアウトマイクロミニピッグの作出
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20K06472
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
三好 和睦 鹿児島大学, 農水産獣医学域農学系, 教授 (70363611)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 正宏 鹿児島大学, 総合科学域総合研究学系, 教授 (30287099) [Withdrawn]
川口 博明 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 准教授 (60325777) [Withdrawn]
井尻 萌 鹿児島大学, 農水産獣医学域獣医学系, 助教 (20836233)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 体細胞核移植 / エレクトロポレーション / マイクロミニピッグ / 凍結保存 / 生殖細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
遺伝子ノックアウト（KO）動物の作出においては、標的遺伝子の両アレルが破壊されている（bi-allelic KO）ことが重要となる。そこで、マイクロミニピッグ（MMpig）体細胞クローン胚にエレクトロポレーション（EP）法を用いて低比重リポタンパク質レセプター遺伝子（LDLR）に対応するCRISPR/Cas9関連成分を導入し、それらに由来する胚盤胞におけるLDLRの変異状況を調べた結果、82%がbi-allelic KOであった。このことから、体細胞クローン胚にEP法を用いてCRISPR/Cas9関連成分を導入することにより、bi-allelic KO MMpigを効率的に作出し得ることが示唆された。よって、EP後の体細胞クローン胚を雌に移植する実験を計画したが、豚熱発生の影響でブタの移動が制限されたため仮親の入手が困難となり、断念した。代わりに遺伝子導入（TG）ブタを効率的に生産するシステムを確立するために、piggyBacシステムの有効性について検討した。その結果、トランスポザーゼmRNAとトランスポゾンDNAをブタ単為発生卵の細胞質に注入することにより、TG胚盤胞を作出し得ることを明らかにした。さらに、作製した体細胞クローン胚をすぐには仮親に移植できない状況に対応するため、新規凍害保護剤であるcarboxylated poly-L-lysineや3,3-dimethylglutaric anhydride poly-L-lysine（DMGA-PLL）を用いたブタ生殖細胞凍結保存技術の確立を試みた。その結果、保存液にDMGA-PLLを添加することにより、精子、胚盤胞および体外受精卵を効率的に凍結保存し得ることを明らかにした。この結果を基にMMpig体細胞クローン胚の凍結保存を試みたが、融解後の胚盤胞形成率は低い値であり、DMGA-PLLを添加しても改善されなかった。
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