[NiFe]ヒドロゲナーゼの酸化に伴う鉄硫黄クラスターの構造変化に関する研究

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K06511
• Research Institution: University of Hyogo
• Principal Investigator: 西川 幸志 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 助教 (80723593)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: [NiFe]ヒドロゲナーゼ / 鉄硫黄クラスター

Outline of Annual Research Achievements

一般に、ヒドロゲナーゼは酸素存在下では不活性化されるが、一部の[NiFe]ヒドロゲナーゼは酸素耐性を持ち酸素存在下でも活性を維持できる。酸素耐性獲得のためには特異な鉄硫黄クラスターを持ち、酸化に伴い鉄硫黄クラスターが構造変化し電子を供給することが重要であることが分かっているが、酸素耐性の無い標準型の[NiFe]ヒドロゲナーゼでも、酸化に伴い鉄硫黄クラスターの構造変化が起こっているようなデータが集まりつつある。本課題では、硫酸還元菌由来の標準型[NiFe]ヒドロゲナーゼの酸化還元に伴う鉄硫黄クラスターの構造変化を調べることで、[NiFe]ヒドロゲナーゼの酸素耐性獲得の要因を検討する。
硫酸還元菌の大量培養を行い、次いでグローブボックス(N2:97%, H2:3%)内で嫌気的に酵素の精製および結晶化を行った。また、得られた結晶を大気に暴露し酸素による酸化型結晶を調製した。これらの２状態についてX線回折実験を行ったが、いずれも目標としていた分解能(1.0-1.5 Å)には届かなかった。そのため、結晶化条件の見直しを行った。沈殿剤である2-methyl-2,4-pentanediol(MPD)は、添加時に反応熱(水和熱)を生じることによって、結晶化母液中の酵素分子にダメージを与えることが考えられたため、MPDの添加速度を遅くすることを試みた。具体的には、0 ℃に設定したドライブロックに、酵素溶液をエッペンチューブに入れたものをセットし、MPDを少量ずつ加えてはガラス棒で撹拌する操作を行った。嫌気条件において従来よりもサイズの大きい結晶を高い頻度で得られるようになった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

2020年度の前半は、コロナ禍によって行動が大きく制限されていたことがあり、研究活動に大幅な制限を受けており、研究活動が可能であったのは実質2020年度の後半のみであったため、当初の予定よりもやや遅れている。

Strategy for Future Research Activity

2021年度は、前年度に行った結晶化条件の最適化により調製された還元型結晶について
X線回折実験を行い、結晶の品質を評価する。もしも品質の向上が見られない場合には、結晶化条件の再度の検討および結晶の凍結方法についても検討を行う。還元型結晶が高品質の回折データセットを与えうる品質にであれば、還元型結晶に対して酸素を作用させ、酸化型結晶を調製する。酸素による酸化は結晶へダメージを与えることが予想されるため、酸素暴露の方法について種々の方法を試みる。また、嫌気的に酸化剤を作用させることにより、酸素によらない酸化についても調査する。