2020 Fiscal Year Research-status Report
免疫活性化受容体LILRA2のリガンド認識機構の解明
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20K06518
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
古川 敦 北海道大学, 薬学研究院, 助教 (30727699)
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2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 免疫受容体 / X線構造解析 / クライオ電子顕微鏡 / タンパク質複合体 / 抗体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
免疫活性型受容体LILRA2 (Leukocyte Immunoglobulin-Like Receptor A2) は、細菌が分泌するプロテアーゼによって抗体のVHとCH1間が切断され、抗原認識部位を失った抗体（切断抗体）を認識することが明らかとなっている。これはこれまでの自然免疫受容体と異なる新たな細菌の感知機構であり非常に興味深い。これまでに、我々は、LILRA2のドメイン2が切断抗体の認識に関わっていることを明らかにしているおり、他のLILRファミリー蛋白質のリガンド認識機構とは異なること可能性が高いことを明らかにしている。しかし、リガンド認識機構の詳細は不明であり、本研究では、LILRA2の構造生物学的に認識機構を明らかにすることを目的とした。
LILR2と切断抗体の構造生物学的な理解を目的に結晶化を試行したが、タンパク質複合体の結晶化には今のところ至っていない。理由として、抗体の持つヒンジ領域の持つ揺らぎが結晶化を阻害していることが考えられたため、ヒンジ領域がない切断抗体のFab領域だけの発現を試みたが、発現量が極めて低く、結晶化まで進むことができなかった。このことは、Fc領域が切断されたFab領域の安定性に寄与している可能性を示唆する。
さらに、複合体構造のクライオ電子顕微鏡による解析も同時に進めた。複合体をクライオ電子顕微鏡で観察した結果、粒子の不均一性が観察された。このことは、上記で述べたような抗体のヒンジ領域の柔軟性による可能性やLILRA2と切断抗体の相互作用はμMオーダーであり、グリッド作製中に２分子が解離している可能性が示唆された。現在、クライオ電子顕微鏡観察に適したサンプル調製法の探索を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでにX線構造解析やクライオ電子顕微鏡を用いて、LILR2と切断抗体の複合体構造の解析を進めてきたが構造決定には至っていない。しかし、クライオ電子顕微鏡による解析の結果、抗体のヒンジ領域の柔軟性、さらには、LILRA2と切断抗体の相互作用はμMオーダーであり、グリッド作製中に２分子が解離による粒子の不均一性があることがわかっている。一方で、その不均一性を克服するために、Grafixと呼ばれる架橋化剤を用いて、複合体を安定化する方法を用いて、安定に精製する方法を検討し、２分子が解離しにくい分子の調製に成功している。
また、幅広くLILRA2の認識機構を明らかにするために新たなリガンドについても認識機構の解明を進めている。その結果、新たに見出されたリガンドでは、切断抗体と異なるリガンド認識機構であることが示唆する結果を得ているため。
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| Strategy for Future Research Activity |
上記で記述したように、クライオ電子顕微鏡によるLILRA2-切断抗体の単粒子解析では、粒子の不均一性がみられ、現在までに構造解析には至っていない。不均一性を克服するために、Grafixと呼ばれる架橋化剤を用いて、複合体を安定化する方法を用いて、安定に精製する方法を検討し、２分子が解離しにくい分子の調製に成功した。このタンパク質複合体を用いて、クライオ電子顕微鏡による構造解析を進める。
また、新たに見出されたリガンドにおいてもX線構造解析もしくはクライオ電子顕微鏡を用いて複合体の構造解析を進める。
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| Causes of Carryover |
今年度は、コロナウイルス感染症による研究活動の制限のために、予定していた研究を進めることができず、計画通りに予算執行ができなかった。次年度は、新たに見出されたリガンドの認識機構の解明も進めるため、未使用額はその経費に充てる予定である。
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