2021 Fiscal Year Research-status Report
繊維芽細胞増殖因子FGF5と受容体の相互作用およびアプタマーの阻害機序の解明
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20K06529
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| Research Institution | Chiba Institute of Technology |
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Principal Investigator |
坂本 泰一 千葉工業大学, 先進工学部, 教授 (40383369)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
堀内 正隆 北海道医療大学, 薬学部, 准教授 (90322825)
杉山 成 高知大学, 教育研究部自然科学系理工学部門, 教授 (90615428)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | アプタマー / FGF |
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| Outline of Annual Research Achievements |
私たちの研究室では，試験管内分子進化法（SELEX法）を用いて，繊維芽細胞増殖因子FGF5に結合するアプタマーの取得にすでに成功している．このアプタマーは，FGF5に対して特異的に，そして強固に結合する（解離定数Kd = 約0.1 nM）ことが明らかとなっているが，その結合メカニズムは明らかになっていない．そこで本研究では， FGF5とアプタマーの相互作用を原子座標レベルで明らかにし，相互作用メカニズムを明らかにすることを目的としている．相互作用メカニズムの解明により，アプタマーを効率的に改変することができるようになると考えられる．
SELEX法により得られたアプタマーには，結合活性に不要なプライマー結合配列が含まれる．そこで，アプタマーを短鎖化した変異体を作成し，56残基でも結合活性を保持することを明らかにした．また，アプタマーは2つのステム・ループ構造と多岐ループを持つことを明らかにし，多岐ループが結合活性に重要であることを明らかにした．このように短鎖化することによって，立体構造の揺らぎが抑えられ，X線結晶構造解析における結晶化に有効であると考えた．アプタマーとFGF5を大量に調製して，様々な条件で結晶化を試みたが，結晶は得られなかった． そこで，アプタマーの配列を一部変えたものを作成し，結晶化を試みたが，結晶は得られなかった．
また， FGF5の受容体であるFGFR1cを調製した．表面プラズモン共鳴（SPR）を用いた競合実験によって，アプタマーとFGFR1cは競合的にFGF5に結合することが明らかとなっている．このアプタマーは，FGF5が原因となって起こる疾病の治療薬と期待することができる．また， FGF5がFGFR1cに結合するメカニズムも明らかになっていないので，FGF5とFGFR1cの複合体の結晶化も試みている．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
新型コロナウイルスの影響によって，大学へ入構制限や研究資材の入手困難な状況が起こり，当初の計画より，やや遅れている．
これまでに，構造解析のためにアプタマーを56残基に短鎖化することに成功している．アプタマーの二次構造予測に基づいて，アプタマーの末端ステムを短くし，SPRを用いてFGF5との結合活性を保持していることを確認した．さらに， T7 RNAポリメラーゼ変異体を用いた転写システムによりアプタマーを大量調製するとともに，化学合成によって修飾アプタマーも調製した．アプタマーとFGF5を用いて，様々な溶液条件で結晶化を試みたが，現在のところ結晶は得られていない．
また，研究分担者の堀内は，大腸菌による大量発現系により，FGF5およびFGFR1cを大量調製した．さらに， FGF5，FGFR1c およびヘパリンの三者複合体の結晶化を行った．FGF5は低塩濃度では沈殿しやすく，高塩濃度ではヘパリンが結合しにくいということが明らかとなった．現在，様々な結晶化条件を検討している．
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| Strategy for Future Research Activity |
構造解析用の試料を大量に調製する方法を確立できているので，今後はNMR解析とX線結晶構造解析を並行して進める計画である．
アプタマーの変異体も用いて，アプタマーとFGF5の複合体の結晶化を，様々な条件で行う．また，NMR解析によって，アプタマーが予想された二次構造を維持していることを確認する．杉山が開発したゲルを用いる手法で結晶化を効率よく行う．結晶が得られたら，杉山がX線結晶構造解析を行う．X線結晶構造解析には，大型放射光施設SPring-8を利用する．
さらに，SPRおよび等温滴定型カロリメトリ（ITC）を用いて，相互作用の速度論的パラメータと熱力学的パラメータを明らかにし， FGF５とFGFRの相互作用をアプタマーが阻害するメカニズムを明らかにする．
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルスの影響によって，大学へ入構制限や研究資材の入手困難な状況が発生した．そのため，当初の計画よりやや遅れてしまい，次年度使用額が生じた．次年度は，より多くの試料を用いて結晶化を進め，X線結晶構造解析による立体構造決定を行う計画である． さらに，NMR解析も並行して進める．結晶が得られたら，杉山がX線結晶構造解析を行う．X線結晶構造解析には，大型放射光施設SPring-8を利用する．次年度使用額は，これら構造解析の費用に使用する．
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