2022 Fiscal Year Research-status Report
繊維芽細胞増殖因子FGF5と受容体の相互作用およびアプタマーの阻害機序の解明
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20K06529
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| Research Institution | Chiba Institute of Technology |
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Principal Investigator |
坂本 泰一 千葉工業大学, 先進工学部, 教授 (40383369)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
堀内 正隆 北海道医療大学, 薬学部, 准教授 (90322825)
杉山 成 高知大学, 教育研究部自然科学系理工学部門, 教授 (90615428)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | アプタマー / FGF |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では，試験管内分子進化法（SELEX法）を用いて，繊維芽細胞増殖因子FGF5に結合するアプタマーの取得にすでに成功している．このアプタマーは，FGF5に対して特異的に，そして強固に結合する（解離定数Kd = 約0.1 nM）ことが明らかとなっているが，その結合メカニズムは明らかになっていない．そこで本研究では， FGF5とアプタマーの相互作用を原子座標レベルで明らかにし，相互作用メカニズムを明らかにすることを目的としている．相互作用メカニズムを明らかにした後，論理的にアプタマーを改変することを目指している．
SELEX法により得られたアプタマーを短鎖化した変異体を作成し，56残基でも結合活性を保持することを明らかにした．また，アプタマーは2つのステム・ループ構造と多岐ループを持つことを明らかにし，多岐ループが結合活性に重要であることを明らかにした．このように短鎖化することによって，立体構造の揺らぎが抑えられ，X線結晶構造解析における結晶化に有効であると考えた．そこで，アプタマーとFGF5を大量に調製して，様々な条件で結晶化を試みたが，結晶は得られなかった．次に，アプタマーをさらに短鎖化したり，DNA配列の導入したキメラ型のアプタマーの作成を試みたが，結合能が低下してしまった．再度，配列を検討し，NMRによるアプタマーの構造の確認を進めている．
また， FGF5の受容体であるFGFR1cを調製した．表面プラズモン共鳴（SPR）を用いた競合実験によって，アプタマーとFGFR1cは競合的にFGF5に結合することが明らかとなっている． FGF5がFGFR1cに結合するメカニズムも明らかになっていないので，FGF5とFGFR1cの複合体の結晶化も試みている．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
新型コロナウイルスの影響による大学へ入構制限は緩和されたが，研究資材の価格高騰もあり，当初の計画より，やや遅れている．
これまでに，構造解析のためにアプタマーを56残基に短鎖化することに成功している．アプタマーの二次構造予測に基づいて，アプタマーの末端ステムを短くし，SPRを用いてFGF5との結合活性を保持していることを確認した．さらに， T7 RNAポリメラーゼ変異体を用いた転写システムによりアプタマーを大量調製するとともに，化学合成によって修飾アプタマーも調製した．これらのアプタマーとFGF5を用いて，様々な条件で結晶化を試みたが，結晶は得られなかった．そこで，アプタマーの改変体を作成し，それらを用いて結晶化することを計画した．具体的には，アプタマーをさらに短鎖化したり，DNA配列の導入したキメラ型のアプタマーを作成したが，結合能が低下してしまった．再度，アプタマーの配列を検討し，NMRによるアプタマーの構造の確認を進めている．
また，研究分担者の堀内は，FGF5の調製のためにGRPタグとカードランビーズを用いた独自の技術を利用しているが，このGRPタグを標的タンパク質に結合させる系を用いて，新しいアプタマーの作成も試みた．GRPタグによりタンパク質を固定化することにより，効率的にアプタマーを取得できることが明らかとなった．GRPタグがRNAと競合的にはたらくことによって，標的タンパク質に対するRNAの非特異的な結合を抑制していると考えられる．
さらに，堀内が大腸菌による大量発現系を用いてFGF5およびFGFR1cを大量調製した．現在， FGF5，FGFR1c およびヘパリンの三者複合体の結晶化を試みている．
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| Strategy for Future Research Activity |
これまで，アプタマー，FGF5およびFGFR1cを大量調製してきた．構造解析用の試料を大量に調製する方法を確立できているので，今後はNMR解析とX線結晶楮解析に適した試料を探索し，それらを大量調製して，実際に構造解析を進める計画である．アプタマーの変異体も用いて，アプタマーとFGF5の複合体の結晶化を，様々な条件で行う．杉山が開発したゲルを用いる手法で結晶化を効率よく行う．結晶が得られたら，杉山がX線結晶構造解析を行う．X線結晶構造解析には，大型放射光施設SPring-8を利用する．
また，結晶化が容易ではないことがわかったので，NMR解析を並行して進める計画である．NMR解析では，NMRシグナルの広幅化や重なりのため，複合体の立体構造決定は容易ではないが，アプタマーのNMR解析から二本鎖構造やループ部分の構造情報を得ることができる．さらに，アプタマーにFGF5を加えたときのアプタマーのNMRシグナルの変化から相互作用部位を特定する．また，FGF5を安定同位体標識してFGF5のNMRシグナルを帰属した後，アプタマーとの結合によりFGF5のNMRシグナルの変化を解析する．FGF5側のアプタマーが結合する面を特定し，アプタマー側の相互作用部位と合わせて，相互作用モデルを作成する．
さらに，SPRおよび等温滴定型カロリメトリ（ITC）を用いて，相互作用の速度論的パラメータと熱力学的パラメータを明らかにし， FGF５とFGFRの相互作用をアプタマーが阻害するメカニズムを明らかにする．
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルスの影響によって，研究資材の価格高騰によって入手困難な状況が発生した．そのため，当初の計画よりやや遅れてしまい，次年度使用額が生じた．次年度は，新たに試料を作成して結晶化を進め，X線結晶構造解析による立体構造決定を行う計画である． さらに，NMR解析も並行して進める．結晶が得られたら，杉山がX線結晶構造解析を行う．X線結晶構造解析には，大型放射光施設SPring-8を利用する．
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