2023 Fiscal Year Annual Research Report
繊維芽細胞増殖因子FGF5と受容体の相互作用およびアプタマーの阻害機序の解明
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20K06529
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| Research Institution | Chiba Institute of Technology |
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Principal Investigator |
坂本 泰一 千葉工業大学, 先進工学部, 教授 (40383369)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
堀内 正隆 北海道医療大学, 薬学部, 准教授 (90322825)
杉山 成 高知大学, 教育研究部自然科学系理工学部門, 教授 (90615428)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | アプタマー / 線維芽細胞増殖因子 / 構造解析 / 物理化学的解析 / ヌクレアーゼ耐性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では，試験管内分子進化法（SELEX法）を用いて，繊維芽細胞増殖因子FGF5に結合するアプタマーの取得にすでに成功している．このアプタマーは，FGF5に対して特異的に，そして強固に結合する（解離定数Kd = 約0.1 nM）ことが明らかとなっているが，その結合メカニズムは明らかになっていない．そこで本研究では， FGF5とアプタマーの相互作用を原子座標レベルで明らかにし，相互作用メカニズムを明らかにすることを目的としている．相互作用メカニズムを明らかにした後，論理的にアプタマーを改変することを目指している．
SELEX法により得られた複数のアプタマーの配列を比較し，それらの配列を組み合わせて短鎖化した変異体を作成した．その結果，アプタマーを42残基まで短くすることに成功し，FGF5の結合活性を保持することを確認した．このように短鎖化することによって，立体構造の揺らぎが抑えられ，X線結晶構造解析における結晶化に有効であると考えた．そこで，アプタマーとFGF5を大量に調製して，様々な条件で結晶化を試みたが，結晶は得られなかった．またFGF5と，その受容体であるFGFR1cとの複合体の結晶化も試みたが，結晶は得られていない．
一方で，NMRによるイミノプロトンシグナルの解析によって，アプタマーは2つのステム・ループ構造と多岐ループを持つことを明らかにした．また，アプタマーの改変体とFGF5の相互作用解析から多岐ループが結合活性に重要であり，2つのステム・ループ構造と末端ステムをDNAに置換できることを明らかにした．DNAへの置換によって血清中での安定性が向上したことから，ヌクレアーゼ耐性が向上したと考えられる．今後，in vivoでの実験をするにあたって重要なステップをクリアした．
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