2020 Fiscal Year Research-status Report
新規直鎖状ユビキチン結合タンパク質ファミリーのNF-κB制御メカニズムの解明
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20K06611
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
高橋 宏隆 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 准教授 (70432804)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ユビキチン結合タンパク質 / ユビキチン鎖 / NF-κB |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度はSurface plasmon resonance（SPR）解析によるZFANDのポリユビキチン鎖特異性の決定を目指した。大腸菌発現系で解析対象とする全てのZFANDを発現させ、Biacoreに用いることが可能な精製度および収量で調整した。これを用いてSPR解析を行なった結果、ZFAND5およびZFAND6についてはKD＝10マイクロM程度のアフィニティで直鎖ポリユビキチン鎖に結合する結果が得られた。この結合力は、既に報告されているA20型ユビキチン結合ドメイン（A20ドメイン）を有するA20のZF7領域とほぼ同等の結合力（ZF7のKDは9マイクロM）を示した。一方で、他の結合様式のユビキチン鎖へのアフィニティは比較的弱いことが予想されるが、現状では正確なデータを得ることができておらず、実験系の最適化を行っている。一方、抗体ビーズを用いたプルダウンアッセイでは、ZFAND5は直鎖ユビキチン鎖のみならず、K48鎖やK63鎖とも結合する結果が得られた。今後、全てのZFANDについて詳細なユビキチン鎖特異性の決定を目指す。さらに、直鎖ユビキチン鎖との結合が弱いZFAND3のA20ドメインと、結合力が強いZFAND5のA20ドメインをスワップした変異体解析により、ZFAND3の最初のZn結合モチーフが結合力の弱さの原因であることが明らかとなった。
また研究協力者の鳥取大学GSC研究センターの佐藤 裕介先生との共同研究より、A20-ZF7や他のA20ドメインのアミノ酸配列のアライメント解析を行い、ZFANDのユビキチン鎖結合に関わるアミノ酸の特定を行なっている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
2020年度は新型コロナウイルス感染拡大に伴い、研究スタート時の４月より所属する大学がほぼ全ての研究活動を禁止する措置を取ったため、その期間の研究遂行が不可能であった。その後も、同ウイルスの感染拡大防止措置のため、いくつかの実験の遂行に大きな遅延が生じた。特に、ドッキングモデル解析やBiacore解析の一部は、研究協力者の佐藤裕介先生の研究室を訪問して実験を遂行する予定であったが、県外をまたぐ移動の自粛により本年度の遂行は断念した。
そのため、本学で遂行可能な実験のみを実施し、佐藤裕介先生とはオンラインとメールでのディスカッションなどを行い、可能な限りの実験の遂行に努めた。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度も新型コロナウイルスの感染に収束の気配がなく、その中で可能な限り研究の遂行に努める。特に、ユビキチン鎖特異性解析やドッキングモデル解析については、当初の計画が遅延しているため、可能な限り今年度にこれらを遂行する。また2021年度に計画している細胞実験については、本学で遂行可能なため、ノックアウト細胞や高発現細胞を用いた解析を行い、個々のZFANDのNF-kBシグナルや炎症シグナルにおける詳細な役割を明らかにする。
またZFANDが機能する細胞については、愛媛大学プロテオサイエンスセンターの今井祐記教授との共同研究により、NF-kBシグナルが深く関与する破骨細胞の分化の際に、ZFAND3、5、6がそれぞれ異なった発現パターンを示すことが明らかとなっている。今後、炎症のみならず骨形成におけるZFANDの役割も明らかにする予定である。
さらに、当初の研究計画には記載していなかったが、私が所属する研究室にて開発された改良型の近接ビオチン化酵素AirIDが、シグナル伝達におけるタンパク質間相互作用において非常に有用であることが明らかとなった。そこで、このAirIDを用いて個々のZFANDの相互作用因子を同定し、ZFANDの機能の更なる解明を目指す。
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| Causes of Carryover |
2020年度はコロナ禍により計画していた研究の多くが遂行できず、試薬・消耗品の購入が最小限となった。また予定していた学会発表がオンラインとなり、研究協力者の佐藤裕介先生の研究室を訪問しての実験が遂行できなかったため、計上していた旅費を使用しなかった。これらの理由により次年度使用額が生じたが、この助成金は2021年度に2020年度に遂行できなかった実験を行うための試薬・消耗品の購入に加えて、2021年度に予定している細胞実験などに関る試薬・消耗品を購入に使用する予定である。
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Research Products
(6 results)
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[Journal Article] MIND Bomb 2 prevents TNF-induced apoptosis via two distinct mechanisms.2021
Author(s)
Osamu Nakabayashi, Hirotaka Takahashi, Kenta Moriwaki, Sachiko Komazawa-Sakon, Fumiaki Ohtake, Shin Murai, Yuichi Tsuchiya, Yuki Koyahara, Yasushi Saeki, Yukiko Yoshida, Soh Yamazaki, Fuminori Tokunaga, Tatsuya Sawasaki, Hiroyasu Nakano
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Journal Title
Commun Biol.
Volume: 4
Pages: 80
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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