オプトジェネティクスを用いた神経血管連関における微小血流調節機序と虚血時の反応性

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K06929
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 冨田 裕 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師(非常勤) (60276251)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 畝川 美悠紀 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 研究員 (10548481) ; 伊澤 良兼 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (90468471)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: オプトジェネティクス / 脳微小循環 / Neurovascular unit / 脳虚血 / 神経科学

Outline of Annual Research Achievements

脳内ではニューロン・グリア細胞・微小血管は神経血管連関（Neurovascular unit (NVU)）を形成し、相互に連絡を取り合っている。NVUを構成するニューロン、アストロサイト、血管平滑筋、ペリサイトなどの脳微小循環調節における役割を解明するため、オプトジェネティクス手法を用いてNVUを構成する特定の細胞種だけに光感受性膜タンパク質・チャネルロドプシン２(ChR2)を発現させたマウスを用い、非侵襲的に細胞特異的に光刺激を加えて細胞を賦活し、脳微小循環調節機序を詳細に検討することを目的とする。
ChR2をニューロンあるいはアストロサイトに発現させたマウスをウレタンで麻酔し、波長460nmのLEDを用いて直径0.5mmの範囲で頭蓋上に光照射することによって当該細胞のみを賦活化し、レーザースペックル血流計を用いて大脳半球表面の血流を連続的に記録した。光刺激によりいずれも光強度依存的に脳血流は増大し、照射部位より広範囲への伝播が認められた。一部の頭頂骨を除去して各種神経阻害薬を滴下、浸潤させることによる薬理学的手法を用いて、血流調節に関わる機序が異なることを明らかにした。次に、二光子顕微鏡を用いて脳微小血管の挙動を検討した。水銀ランプ(波長470～490nm)により脳表への光刺激を施し、脳表から深さ0-400μmの範囲で脳表軟膜動脈および実質内穿通動脈の刺激前後の口径を解析した。アストロサイト刺激時は脳表から実質内動脈で一様に拡張したが、ニューロン刺激時には脳表動脈と比較し実質内動脈でより顕著に拡張することを明らかにした。
次に血管平滑筋(PV-ChR2)あるいは血管平滑筋とペリサイト(NG2-ChR2)にChR2を発現したマウスを用い、光照射によって脳血流の低下とその伝播、動脈の顕著な収縮反応を確認した。その反応は血管の太さ、分岐レベルによって差異があることを明らかにした。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

安定した発現を呈する遺伝子組換えマウスが一時減少したが、その後は順調に供給されるようになった。既に手法が確立して例数を重ねている段階であり、次の課題に取り組む準備ができていると考える。

Strategy for Future Research Activity

NVU、特に微小血管を構成する細胞種（血管平滑筋、ペリサイトなど）にChR2を発現したマウスを使用し、二光子顕微鏡で水銀ランプによる脳全域刺激あるいは二光子レーザーによる単一細胞刺激による動脈、細動脈、静脈、毛細血管の挙動および伝播を観察する。静脈内に蛍光マイクロビーズを投与して微小塞栓形成を観察し、光刺激による微小血管収縮時との差異を検証し、血行力学的寄与を検討する。さらに、当該マウスを用いて中大脳動脈閉塞術による脳梗塞等の病態モデルを作成し、血流調節機能が維持されているか否かを長期間反復して in vivo 解析するとともに、光刺激に対する反応性、慢性光刺激による影響を検討する。これらによって脳血流・脳機能を維持/向上するための方策を探求する。

Causes of Carryover

安定した発現を呈する遺伝子組換えマウスが一時減少したために、マウスの飼育費用が抑えられた。また、それまでの備蓄品で実験を行うことができたため、新たな消耗品の購入も少なかった。今後は脳梗塞モデルの作成やコントロールマウスとの比較を含めてin vivo実験を進めると同時に、国内外の学会・論文発表に向けて学会参加、英文校正、投稿に要する費用に対して使用する予定である。

Research Products

• [Journal Article] MRS-measured glutamate versus GABA reflects excitatory versus inhibitory neural activities in awake mice. (2022)
  • Author(s): Takado Y., Takuwa H., Sampei K., Urushihata T., Takahashi M., Shimojo M., Uchida S., Nitta N., Shibata S., Nagashima K., Ochi Y., Ono M., Maeda J., Tomita Y., Sahara N., Near J., Aoki I., Shibata K., Higuchi M.
  • Journal Title: J. Cereb. Blood Flow Metab. Volume: 42 Pages: 197-212
  • DOI: 10.1177/0271678x211045449
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Time Series Tracking of Cerebral Microvascular Adaptation to Hypoxia and Hyperoxia Imaged with Repeated In Vivo Two-Photon Microscopy. (2021)
  • Author(s): Sugashi T., Niizawa T., Suzuki H., Takuwa H., Unekawa M., Tomita Y., Kanno I., Masamoto K.
  • Journal Title: Adv. Exp. Med. Biol. Volume: 1269 Pages: 323-327
  • DOI: 10.1007/978-3-030-48238-1_51
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A genetically targeted reporter for PET imaging of deep neuronal circuits in mammalian brains. (2021)
  • Author(s): Shimojo M., Ono M., Takuwa H., Mimura K., Nagai Y., Fujinaga M., Kikuchi T., Okada M., Seki C., Tokunaga M., Maeda J., Takado Y., Takahashi M., Minamihisamatsu T., Zhang M. R., Tomita Y., Suzuki N., Maximov A., Suhara T., Minamimoto T., Sahara N., Higuchi M.
  • Journal Title: EMBO J. Volume: 40 Pages: e107757
  • DOI: 10.15252/embj.2021107757
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Dynamic alterations in the central glutamatergic status following food and glucose intake: in vivo multimodal assessments in humans and animal models. (2021)
  • Author(s): Kubota M., Kimura Y., Shimojo M., Takado Y., Duarte J. M., Takuwa H., Seki C., Shimada H., Shinotoh H., Takahata K., Kitamura S., Moriguchi S., Tagai K., Obata T., Nakahara J., Tomita Y., Tokunaga M., Maeda J., Kawamura K., Zhang M. R., Ichise M., Suhara T., Higuchi M.
  • Journal Title: J. Cereb. Blood Flow Metab. Volume: 41 Pages: 2928-2943
  • DOI: 10.1177/0271678x211004150
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Optical manipulation of local cerebral blood flow in the deep brain of freely moving mice. (2021)
  • Author(s): Abe Y., Kwon S., Oishi M., Unekawa M., Takata N., Seki F., Koyama R., Abe M., Sakimura K., Masamoto K., Tomita Y., Okano H., Mushiake H., Tanaka K. F.
  • Journal Title: Cell Rep. Volume: 36 Pages: 109427
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2021.109427
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Vasoconstriction and hypoperfusion induced by photoactivation of the ChR2-expressing vascular cells. (2021)
  • Author(s): 冨田裕, 村田樹里, 畠山菜緒, 畝川美悠紀, 伊澤良兼, 菅野巌, 田中謙二, 正本和人, 中原仁
  • Organizer: 第62回日本神経学会学術大会
• [Presentation] オプトジェネティクスを用いた脳微小血管の操作 (2021)
  • Author(s): 小谷真穂, 村田樹里, 大石光洋, 畠山菜緒, 畝川美悠紀, 伊澤良兼, 菅野巖, 冨田裕, 田中謙二, 中原仁, 正本和人
  • Organizer: 第25回酸素ダイナミクス研究会
• [Presentation] マウス大脳皮質におけるミクログリアの長期観察と低酸素暴露への適応 (2021)
  • Author(s): 須貸拓馬, 結城浩弥, 畝川美悠紀, 冨田裕, 菅野巖, 中原仁, 正本和人
  • Organizer: 第25回酸素ダイナミクス研究会
• [Presentation] 生体脳イメージングを用いたタウ凝集体を有する神経細胞の脳外排出メカニ ズムの実証 (2021)
  • Author(s): 高橋真奈美, 田桑弘之, 漆畑拓弥, 下條雅文, 折原あすみ, 小野麻衣子, 高堂祐平, 冨田裕, 佐原成彦, 須原哲也, 樋口真人
  • Organizer: 第64回日本脳循環代謝学会学術集会