2020 Fiscal Year Research-status Report

The mechanism of polyamine stimulation of purine nucleotide biosynthesis

Research Project

Project/Area Number	20K07012
Research Institution	International University of Health and Welfare
Principal Investigator	西村和洋国際医療福祉大学, 薬学部, 教授 (60302569)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	内田雅士千葉大学, 大学院薬学研究院, 助教 (90824574)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	プリンヌクレオチド / Paics / 遺伝子ノックダウン / イノシン一リン酸
Outline of Annual Research Achievements	（１）マウス乳がん由来FM3A細胞をポリアミン生合成阻害剤存在下で培養すると細胞増殖阻害と共にイノシン一リン酸（IMP）が減少することをメタボロームによる網羅解析で得ていた。そこで、HPLCを用いてIMPの正確な定量分析を行った。その結果、HPLCによる分析においてもIMPが有意に減少することを明らかにした。続いて、マウス繊維芽細胞株であるNIH3T3細胞をポリアミン生合成阻害剤存在下で培養したところ、プリンヌクレオチド合成酵素のPaics遺伝子の発現量はmRNAレベルは変化せずに蛋白質量が低下することをqRT-PCRおよびWestern blottingにて確認した。（２）上記の結果を受けて、NIH3T3細胞に対してshRNA発現ベクターを用いた遺伝子ノックダウンを行い、細胞増殖への影響を調べた。その結果、コントロールと比べて、Paics遺伝子のノックダウンにより細胞増殖は強く阻害されたため、NIH3T3細胞でのプリンヌクレオチド生合成経路は細胞増殖に重要であることが明らかになった。（３）続いて、NIH3T3細胞に対してポリアミン生合成阻害剤処理もしくはPaics遺伝子ノックダウンを行い、IMPの添加が細胞増殖へ与える影響を検討した。IMPの添加はポリアミン生合成阻害による細胞増殖阻害からの回復に影響を与えなかった。また、Paics遺伝子ノックダウンを行ったNIH3T3細胞に対しても細胞増殖の回復は見られなかった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason FM3A細胞とNIH3T3細胞において、ポリアミン生合成阻害がPaics遺伝子の発現量低下を示すことを明らかにすることができた。しかしながら、IMPによる細胞増殖阻害からの回復は見出すことができなかった。
Strategy for Future Research Activity	FM3A細胞とNIH3T3細胞という異なる細胞株において、ポリアミン生合成阻害によりPaics遺伝子の発現が抑制されるという共通した現象が確認できた。そのため、FM3A細胞で見られたIMPの減少が、NIH3T3細胞でも見られるのかを定量分析する。Paics遺伝子をノックダウンしたNIH3T3細胞の細胞増殖は阻害されるため、IMP添加による細胞増殖回復実験を行ったが、回復が見られなかった。その原因として、IMPが細胞内へ取り込まれないことが予想された。そこで、細胞への取り込みが可能と考えられるヒポキサンチンの添加による回復実験を進める。ヒポキサンチンは細胞内に取り込まれた後、サルベージ経路によりIMPを産生することができる。以上のことから、ポリアミンによるプリンヌクレオチド代謝制御の解析には、de novo経路だけではなくサルベージ経路の関与も視野に入れて解析を進める。
Causes of Carryover	年度末までに物品購入の見積額と実際の購入額の差額が出たため、少額の次年度使用額が生じた。