2020 Fiscal Year Research-status Report
PHD阻害薬による自然免疫活性化に基づく抗腫瘍メカニズムの解明と治療標的の探索
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20K07072
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| Research Institution | Osaka City University |
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Principal Investigator |
冨田 修平 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (00263898)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 低酸素 / 腫瘍免疫 / HIF-PH阻害薬 / マクロファージ / がん微小環境 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
腫瘍組織における低酸素誘導転写因子（HIF）の恒常的な活性化は，がんの進展や転移を促進する。また、腫瘍内マクロファージ（Mφ）は、がん微小環境により腫瘍増殖や転移を促進する形質を付与される。その一方で、LPSやIFNγによるMφの活性化は腫瘍進展に対して抑制的作用を示す。申請者は，腫瘍移植モデル動物実験において，HIFシグナルを増強するHIF-PH阻害薬が、腫瘍内のMφ亜集団に直接作用することにより腫瘍増殖を抑制して生存期間を延長させることを見出した。本研究の目的は，PHD-HIFを基軸とした詳細な分子解析を通して、HIF-PH阻害薬により形質変換した腫瘍内Mφが抗腫瘍効果をもたらす機序を明らかにすることを第一目的とする。また、本研究の遂行は、現在の腫瘍免疫療法では難治性を示すがんに対して，自然免疫の活性化過程を標的とした新しい腫瘍免疫療法を創出する可能性を有しており、新規創薬研究分野にも繋がることが期待される。
本研究では、PHD-HIFシグナルの活性化による腫瘍内Ly6CloMφの貪食作用の促進機序の解明を目指す。とくに貪食開始の引き金となる腫瘍細胞の認識機序には深く着目する。また、Mφを介する細胞障害性Ｔ細胞などの獲得免疫機能の賦活化に対する影響を検証する。今年度は，腫瘍内MφのLy6Clo集団の貪食作用の促進機序の解明を目的に，トランスクリプトーム解析によるHIFを介する発現変動遺伝子群の探索，およびHIFシグナルを介する貪食関連分子の同定および機能解析を進めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本年度は，腫瘍内MφのLy6Clo集団の貪食作用の促進機序の解明を進めた。まず，HIF-PH阻害薬により形質変化するLy6CloMφ画分を採取して、腫瘍細胞の貪食促進に寄与する鍵となる分子機序を同定することを試みた。具体的には、HIF-PH阻害薬の処置したマウス、MφにおいてHIFシグナルが増強される遺伝子改変マウス（Vhlflox/flox;Hif-1αflox/flox;LysM-Cre（Hif-2α発現増強モデル）、およびVhlflox/flox;Hif-2αflox/flox;LysM-Cre（Hif-1α発現増強モデル））を用いて、Lewis肺癌細胞株、B16メラノーマ細胞株などを担がんした動物モデルを作製して、その腫瘍組織からLy6CloMφ画分の採取を行い，また骨髄由来Mφ (BMDM)を調製してトランスクリプトーム解析によるHIFを介する発現変動遺伝子群の探索実験に使用した。まず，Ly6CloMφ画分あるいはBMDMを採取・調製して、網羅的遺伝子発現解析を行った。腫瘍組織より採取されるMφ画分には、貪食された腫瘍細胞も含まれており、その遺伝子発現背景も含めて、HIF-PH阻害薬処置の有無あるいは各HIF発現増強マウスの発現差分を解析した。同時に、腫瘍細胞を含まないBMDMについても同様の実験を行う。Gene Set Enrichment解析などの結果からどのような機能性遺伝子の発現変動があるのかを解析した。また，経時的顕微鏡観察の予備実験より、貪食開始の引き金にはMφと腫瘍細胞の物理的な接触が必要と考えられるので、上述と同様に準備されたMφから膜分画を調製してプロテオーム解析を実施した。その機能的発現差分解析により候補遺伝子を抽出した。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度にかけて，腫瘍内MφのHIFシグナル増強による獲得免疫機能の賦活化に関する検証を進める。HIFシグナルを介してMφの貪食作用が促進されると、ファゴリソソーム内で消化された細胞外由来のペプチドの抗原提示能も上昇すると考えられる。その結果として獲得免疫応答の促進効果が期待できる。そこで、Mφの形質変化から獲得免疫応答の主役である細胞障害性Ｔ細胞の活性化までを検証し、HIFシグナルによるMφ活性化による抗腫瘍効果の全体像の様子を理解する。具体的には、まず、これまでの知見より、担がんマウスモデルを用いて、M1型様あるいはM2型様Mφの各種発現マーカーのほか、スカベンジャー受容体やマンノース受容体などの貪食や自己・非自己の認識に関わる分子の発現を検証する。同時に他の自然免疫系細胞のNK細胞、樹状細胞、NKT細胞の発現も確認する。次に、Mφの抗原提示に関わる分子群（MHCII、LIP10、CLIP、他）の発現を確認する。最後にＴ細胞各サブセットおよびその活性化マーカー発現についてフローサイトメータで解析する。
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| Causes of Carryover |
予定していたトランスクリプトーム解析総額および動物維持経費に差額が生じたため。
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[Book] エース薬理学2020
Author(s)
金井好克、安西尚彦、安藤 仁、浅井 聰、冨田修平
Total Pages
303
Publisher
南山堂
ISBN
978-4-525-14071-7
