2020 Fiscal Year Research-status Report
自己免疫性膵炎発症に関与するサイトカインのメチル化異常の解析と病理診断への応用
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20K07405
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| Research Institution | Shinshu University |
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Principal Investigator |
上原 剛 信州大学, 学術研究院医学系, 准教授 (80402121)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松田 和之 信州大学, 学術研究院保健学系, 教授 (00647084)
増本 純也 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 教授 (20334914)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 自己免疫性膵炎 / メチル化 / IgG4 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は第１に自己免疫性膵炎（AIP）のIgG4 産生および線維化は被障害臓器のエピゲネティックな修飾によるサイトカインの発現異常によって生じていること、第２に疾患特異的な共通のサイトカイン制御に関与するエピゲネティックな修飾を特定し、それらメカニズムに基づき、遺伝子発現レベルや蛋白発現レベルを解析することである。
現在、様々な臓器でのIgG4 関連疾患が認識されるようになってきており、共通の分子基盤に立った線維化および炎症制御のメカニズムを解析する意義は大きい。これらの検討は、IgG4 関連疾患の原因究明、適切な診断の一助になるとともに、治療方法開発にもつながると考えられる。
①AIP のIgG4 産生および線維化関連サイトカイン遺伝子のメチル化レベルをメチル化アレイ解析から原因遺伝子候補を選択した。過去に行ったメチル化アレイ解析の結果を用いて解析した。メチル化アレイ解析はAIPの炎症部、膵臓癌の閉塞性膵炎部、正常膵およびそれぞれの所属リンパ節に対して、DNAをマイクロダイセクションで抽出し、その後抽出されたDNAにbisulfite処理を行い、メチル化アレイ解析法である、イルミナ社のHuman Methylation 450 BeadChip を用いて行われた。症例は信州大学医学部附属病院および協力施設から収集した。数万の候補遺伝子をエクセル上で解析し炎症や線維化に関する候補遺伝子をリスト化した。
②より正確なメチル化レベルを得るために定量的メチル化解析法である、定量Methylation Specific PCR(MSP)を用いて、原因候補遺伝子のメチル化レベルを解析するために症例を追加し、プライマー設計など行った。試薬などの準備も行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
AIP症例の選択に関しては信州大学医学部附属病院で手術が行われ、AIPと診断されたた症例をレトロスペクティブに検索し、試料として用いることができた。また不足分に関しては近隣協力施設から、新規追加分の試料を提供の協力が得られ必要数を確保できた。
またAIPの線維化および炎症制御に関わる遺伝子のメチル化レベルをアレイ及びメチル化定量法で計測する事に関しては、AIPの炎症部、膵臓癌の閉塞性膵炎部、正常膵およびそれぞれの附属リンパ節に対して、DNAをマイクロダイセクションで抽出し、その後抽出されたDNAにbisulfite処理を行い、メチル化アレイ解析法である、Infinium MethylationEPIC BeadChipを用いて原因候補遺伝子を確定した。
さらにより正確なメチル化レベルを得るために定量的メチル化解析法である、定量Methylation Specific PCR(MSP)を用いて、原因候補遺伝子のメチル化レベルを解析する予定であったが、新型肺炎の影響などもあり、さらなる追加資料の収集に時間がかかっており、行えていない。しかしながらプライマーや試薬は準備できており、資料収集のめども立っており近日中に解析予定である。したがってやや遅れているとした。
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| Strategy for Future Research Activity |
追加資料を加えた上で、再度メチル化アレイ解析を行い候補遺伝子を検索する。また定量Methylation Specific PCR(MSP)を用いて、線維化および炎症制御に関わる原因候補遺伝子のメチル化レベルを解析する。
またこれまでに同定された原因候補となる遺伝子に対して、AIPの炎症部、膵臓癌の閉塞性膵炎部、正常膵、リンパ節のパラフィンブロックからmRNAを抽出し、関連遺伝子の異常な発現の有無をRT-PCRで確認する。
また線維化および炎症制御に関わる原因候補遺伝子の蛋白発現の有無を、タンパクに対するモノクロナル抗体を用いて免疫染色で確認する。原因候補遺伝子によって作られるタンパク質に対する抗原が免疫染色によって確認できればメチル化による影響を目視で確認可能となる。目的遺伝子に対する、免疫染色用の抗体が市販されていれば、それらを用いて免疫染色を行う。市販されているがん関連遺伝子に対する免疫染色用抗体は特異性の低い場合が多いので、染色がうまくいかない場合には、独自に原因候補遺伝子に対する抗体の作製を目指す。
原因候補遺伝子によって作られるタンパク質に対する抗原が免疫染色によって確認できればIgG4関連疾患の原因究明につながり、また病状の把握が可能となる。
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| Causes of Carryover |
メチル化アレイ解析およびメチル化特異的PCRを行っていないので、使用額に差が生じているが、いずれも解析予定であり当初の予算を使用予定である。
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Research Products
(5 results)
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[Journal Article] A comparison of the features of fluorine-18 fluorodeoxyglucose-positron emission tomography (FDG-PET) between IgG4-related disease with bilateral hilar lymphadenopath2020
Author(s)
Ozawa Y, Yamamoto H, Yasuo M, Komatsu M, Ushiki A, Hamano H, Uehara T, Kawakami S, Fujita A, Fujinaga Y, Oguchi K, Kawa S, Hanaoka M
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Journal Title
Nagoya J Med Sci
Volume: 82
Pages: 101-111
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Guidance for diagnosing autoimmune pancreatitis with biopsy tissues2020
Author(s)
Notohara K, Kamisawa T, Fukushima N, Furukawa T, Tajiri T, Yamaguchi H, Aishima S, Fukumura Y, Hirabayashi K, Iwasaki E, Kanno A, Kasashima S, Kawashima A, Kojima M, Kubota K, Kuraishi Y, Mitsuhashi T, Naito Y, Naitoh I, Nakase H, Nishino T, Ohike N, Sakagami J, Shimizu K, Shiokawa M, Uehara T, et al.
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Journal Title
Pathol Int
Volume: 70
Pages: 699-711
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Immunostaining With Immunoglobulin G Subclass Antibody Cocktail for Diagnosis of Type 1 Autoimmune Pancreatitis2020
Author(s)
Nakata R, Uehara T, Iwaya M, Asaka S, Kobayashi S, Sugano M, Higuchi K, Kusama Y, Nakazawa K, Nakaguro M, Kobayashi M, Tateishi A, Makino M, Kawaguchi K, Maejima T, Ishii K, Sano K, Shimojo H, Hori A, Otsuki T, Hamano H, Kawa S, Ota H
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Journal Title
Int J Surg Pathol
Volume: 28
Pages: 844-849
DOI
Peer Reviewed
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