2021 Fiscal Year Research-status Report
マルチプレックスRT-PCR法による成人T細胞白血病の病期進展リスク評価法の開発
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20K07700
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| Research Institution | Saga University |
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Principal Investigator |
中村 秀明 佐賀大学, 医学部, 助教 (10452616)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
末岡 榮三朗 佐賀大学, 医学部, 教授 (00270603)
佐藤 明美 佐賀大学, 医学部, 助教 (20568357)
勝屋 弘雄 佐賀大学, 医学部, 講師 (80632041)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 成人T細胞白血病・リンパ腫 / HTLV-1 / マルチプレックスRT-PCR / ATL / リスク評価 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
HTLV-1感染者のリスク評価
前年度と同様に、佐賀大学医学部附属病院を受診したHTLV-1感染者の血液検体、フローサイトメーターを用いた解析を行った。これまでの報告からCD4陽性Tリンパ球の中でCADM1発現の高い細胞を多く含むHTLV-1感染者はHTLV-1感染細胞が多く、成人T細胞白血病・リンパ腫（ATL）の発症リスクが高いことが知られている。したがって、HTLV-1感染者のCADM1発現細胞割合、臨床検査値などのリスト作成を行い、HTLV-1感染細胞分離を行うHTLV-1感染者の抽出、経時的変化の検討を行った。今年度、ATLを発症したHTLV-1感染者は認めていないが、ATLの病期が進展した症例があり、経時的な検体保存を行った。
HTLV-1感染細胞と非感染細胞の分離
前述のリストから、研究の説明・同意が得られたCADM1発現細胞割合の高いHTLV-1感染者の血液検体からフィコール分離液を用いて末梢血単核球（PBMC)の分離を行った。PBMCの一部を保存し、残りは磁気ビーズ、CD4陽性細胞分離キットを用いてPBMCからCD4陽性細胞集団を単離した。更に、CD4陽性細胞集団の中で、CADM1発現の高いHTLV-1感染細胞と、CADM1発現の低いHTLV-1非感染細胞に磁気ビーズ、CADM1抗体を用いて分離を行った。分離後はフローサイトメーターで目的細胞が得られていることを確認した。分離した細胞からRNA抽出、cDNA合成を行い、qPCR解析を行った。
網羅的遺伝子発現解析
GEOデータベースに登録されている、HTLV-1感染者検体の発現データを抽出。ATL未発症者と発症者の比較を行い、ATL発症者で特異的に発現が亢進または低下している遺伝子の抽出を行った。また、CADM1発現の違いの大きい検体を用いて次世代シーケンサーによるRNAseq解析を行なった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
前年度に比べ新型コロナウイルスによる影響は少なくなり、おおむね順調に進展している。HTLV-1感染者の来院数は前年度より増え、またマルチプレックスRT-PCRを行うのに必要な試薬等の確保も可能となった。
フローサイトメーターを用いて約200例のHTLV-1感染者のリスク評価を行い、その中からATL発症リスクの高いHTLV-1感染者：4名、くすぶり型ATL：8名、慢性型ATL：1名のHTLV-1感染細胞と非感染細胞の分離を行い、-80℃に保存した。分離した検体からRNA抽出、cDNA合成を行いCADM1や内在性コントロールとしてβ-actinの qPCRを行った。また、ATL発症やATL進展を認めた際に、HTLV-1感染細胞と非感染細胞の分離を効率的に行えるよう、45名のPBMCを細胞凍結保存液で保存した。CADM1発現の違いが大きい患者検体を用いてRNAseqを行い、得られた結果の解析を行なっている。
GEOデータベースを用いた解析から、ATL発症者で未発症者に比べ2倍以上に亢進または低下した遺伝子を抽出し、既報のCADM1, FOXP3, CD7, RNF130のqPCR解析用プライマー、プローブの設計を行なった。また、未報告の遺伝子についても同様にプライマー、プローブの設計を行い、マルチプレックスRT-PCRのプライマーやプローブ濃度などの条件検討を行なった。これまでに行ったフローサイトメーターを用いたHTLV-1感染者のリスク評価については、臨床検査データや臨床経過を集約して統計解析を行い、学会での発表を行い、学術誌へ投稿するための論文原稿を作成した。また、リスク評価を行った症例の検体や臨床情報を共同研究者に提供し、論文の共著者や学会発表の共同演者として尽力した。
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| Strategy for Future Research Activity |
HTLV-1感染者のリスク評価、HTLV-1感染細胞と非感染細胞の分離
継続的にHTLV-1感染者のリスク評価を行い、HTLV-1発症リスク、ATL進展リスクの高いHTLV-1感染者の抽出、モニタリングを行う。臨床医と定期的に情報交換を行い、経時的なHTLV-1感染者のリスク評価をすることでATL発症の兆候や、ATL病期の進展を捉える。HTLV-1感染者の検体は貴重なため、今後の研究のためにも可能な限り検体の保存を行い、分離したHTLV-1感染、HTLV-1非感染細胞からRNA抽出、cDNA合成を行う。cDNAを用いて、データベース解析から抽出した遺伝子や既に報告されている遺伝子の発現についてqPCR法で分離した検体の検証を行う。
標的遺伝子の絞り込み、マルチプレックスPCR解析
ATLの病期が進展した患者検体の網羅的遺伝子発現解析を行い、登録データベースの発現解析データ、次世代シーケンスの結果を組み合わせて解析する。解析によりHTLV-1感染細胞特異的な遺伝子発現パターン、標的遺伝子の絞り込みを行う。ATLを発症したHTLV-1感染者や、ATLの病期が進展した患者検体が得られれば、追加で網羅的遺伝子発現解析を行う。絞り込んだ標的遺伝子の発現について、qPCRにて評価を行い、内在性コントロール（β-actinやGAPDHなど）を用い、同一チューブ内で標的遺伝子と内在性コントロールの発現評価が効率よく行えるプライマー、プローブ設計、蛍光色素の組み合わせなどの検討を行う。
これまでに行ったフローサイトメーターを用いたHTLV-1感染者のリスク評価や本研究の経過について、学会発表や学術誌への論文投稿を行う。また、本研究から得られたHTLV-1感染者のリスク評価や臨床情報、保存検体などの有効な利活用を熟慮する。
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| Causes of Carryover |
前年度と同様に新型コロナウイルスの影響が続いており、新型コロナウイルスの蔓延時にマルチプレックスRT-PCRに用いるPCR試薬や消耗品の供給に遅れが生じた。また、多くの学会が中止や延期になり、学内の規定に従い県外や海外での学会への参加を取りやめたためことにより、次年度使用額が生じた。加えて、今年度中に論文投稿料を予定していたが、アクセプトに至らなかったため次年度での使用に予定を変更したことも影響した。
これまでの経験を活かし、来年度は早々に試薬類を確保し、これまでに保存した検体の解析を進める。また、年度内に論文が受理されるよう綿密な計画を立てる。複数の研究分担者で次年度使用額が生じているため、計画的な利用を促す。
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[Journal Article] HTLV-1 infection promotes excessive T cell activation and transformation into adult T cell leukemia/lymphoma2021
Author(s)
BJY Tan, K Sugata, O Reda, M Matsuo, K Uchiyama, P Miyazato, V Hahaut, M Yamagishi, K Uchimaru, Y Suzuki, T Ueno, H Suzushima, H Katsuya, M Tokunaga, Y Uchiyama, H Nakamura, E Sueoka, A Utsunomiya, M Ono, Y Sato
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Journal Title
Journal of Clinical Investigation
Volume: 131
Pages: e150472
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Presentation] 胸腺過形成，低ガンマグロブリン血症を有する成人 T 細胞白血病患者において異なる発症形式を示した赤芽球癆2021
Author(s)
Yasushi Kubota, Haruhiko Sano, Kyosuke Yamaguchi, Hideaki Nakamura, Keita Kai, Kesisuke Kidoguchi, Kana Kusaba, Haruna Kizuka-Sano, Masako Yokoo, Toshihiko Ando, Eisaburo Sueoka, Shinya Kimura
Organizer
第83回日本血液学会学術集会
